MÉTODOS PARA REDUCIR POLIPÉPTIDOS DE BETA-AMILOIDE.

Esta invención se refiere a polipéptidos de ß-amiloide (Aß), y más particularmente a métodos para reducir polipéptidos de Aß usando un extracto, o una fracción activa del mismo, de Cimicifuga. ANTECEDENTES Los pacientes con enfermedad de Alzheimer (AD) típicamente son presentados a un médico por un pariente que ha observado una decadencia en la memoria con o sin un cambio en otras capacidades cognitivas tales como decadencias en la función ejecutiva, dificultad para encontrar las palabras o deterioro visuoespacial tal como una incapacidad para dibujar estructuras geométricas complejas o perderse en lugares familiares. El análisis neuropatológico de cerebros de pacientes con AD ha revelado una pérdida neuronal y sináptica intensiva en regiones cerebrales seleccionadas, nudos neurofibrilares y la deposición de polipéptidos de ß-amiloide (Aß) en forma de placas seniles en todo el hipocampo y el neocórtex. Los polipéptidos de Aß se producen a partir de la proteína precursora de amiloide (APP) a través de las acciones proteolíticas combinadas de ß- y -secretasas y se secretan a continuación al medio extracelular. Los estudios bioquímicos e inmunocitoquímicos han revelado que los polipéptidos de Aß depositados en cerebros de pacientes con AD tienen una heterogeneidad amino- y carboxilo-terminal sustancial y pueden contener de 39 a 43 residuos de aminoácido, siendo el ß-amiloide 1-40 (Aß40) y 1-42 (Aß42) los más predominantes. Al comparar las señales obtenidas usando anticuerpos dirigidos al extremo amino de Aß con las obtenidas al capturar el péptido de un epítopo interno, se encontró que virtualmente todo el Aß42 en un cerebro con AD está modificado y/o truncado aminoterminalmente. SUMARIO ES 2 367 895 T3 La invención presenta métodos para reducir el nivel de un polipéptido de Aß usando un extracto de Cimicifuga. La invención también presenta métodos para producir una fracción activa de un extracto de Cimicifuga. Una fracción activa es una que es capaz de reducir el nivel de un polipéptido de Aß en o secretado de una célula (in vitro o in vivo). En un aspecto, la invención proporciona métodos para reducir el nivel de un polipéptido de ß-amiloide (Aß) en o secretado de una célula in vitro. Los métodos incluyen poner en contacto la célula con una cantidad de un extracto de Cimicifuga o de una fracción activa del mismo en una cantidad que sea eficaz para reducir el nivel del polipéptido de Aß y verificar el nivel del polipéptido de Aß en o secretado de la célula. Células representativas incluyen células H4, células M17, células 293, células de ovario de hámster chino (CHO), fibroblastos primarios, C6, cultivos neuronales primarios, cultivos cerebrales mixtos primarios, Daoy, SK-N-SH, SK-N-AS y SK-N-FI. En otro aspecto de la invención, se proporciona un extracto de Cimicifuga o una fracción activa del mismo para el uso en el tratamiento o la prevención de la enfermedad de Alzheimer en un mamífero. La invención también proporciona el uso de un extracto de Cimicifuga o una fracción activa del mismo para la fabricación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de la enfermedad de Alzheimer. Estos aspectos de la invención se refieren al uso de un extracto de Cimicifuga o un fragmento activo del mismo para tratar a un mamífero que tiene AD o con riesgo de desarrollar AD. En estos aspectos de la invención, una cantidad de extracto de Cimicifuga o una fracción activa del mismo se administra al mamífero en una cantidad que es eficaz para tratar o prevenir la AD. Generalmente, el extracto o la fracción activa del mismo se administra a un mamífero oralmente, intravenosamente, intracranealmente, intracerebralmente, subcutáneamente, intramuscularmente, intranasalmente o intraperitonealmente. Un mamífero representativo es un roedor, por ejemplo, un ratón. En una realización, el ratón expresa una APP que tiene una mutación sueca. Un ejemplo de tal ratón es un ratón Tg2576. El extracto de Cimicifuga o la fracción activa del mismo puede ser de C. racemosa, y además puede obtenerse a partir de la raíz o el rizoma de una planta de C. racemosa. El extracto de C. racemosa es generalmente un extracto etanólico o acuoso. Un componente activo dentro de una fracción activa puede ser soluble en un disolvente tal como dicloruro de metileno, acetato de etilo y n-butanol, y los componentes activos solubles en tales disolventes son típicamente lipófilos. Un componente activo dentro de una fracción activa que sea capaz de reducir el nivel de un polipéptido de Aß puede tener un peso molecular de menos de 10 kD. Una reducción en el nivel de un polipéptido de Aß puede deberse a una producción disminuida del polipéptido de Aß o un catabolismo incrementado del polipéptido de Aß. En una realización de la invención, el nivel del polipéptido de Aß se reduce en al menos 10%, al menos 25%, al menos 50% o al menos 80% en comparación con el nivel del polipéptido de Aß en o secretado de una célula correspondiente que no está en contacto con el extracto o la fracción 2 activa del mismo. Una reducción en el nivel de un polipéptido de Aß puede ser una reducción en el nivel de Aß40 o Aß42. Adicionalmente, la reducción en el nivel de un polipéptido de Aß puede ser una reducción preferente en el nivel de Aß42. Además, el extracto o la fracción activa del mismo típicamente no debe tener un efecto significativo sobre el nivel de uno o más de APP, CTF, CTFß o sAPP. En otro aspecto más de la invención, se proporcionan métodos para producir una fracción activa de un extracto de Cimicifuga que reduce el nivel de un polipéptido de Aß durante el contacto con una célula. Los métodos incluyen obtener un extracto de material vegetal de Cimicifuga, fraccionar por tamaños el extracto a través de un filtro para obtener una fracción activa, y probar la fracción activa para confirmar que la fracción activa reduce el nivel de un polipéptido de Aß. En este aspecto de la invención, una fracción activa contiene componentes activos que tienen un peso molecular de menos de aproximadamente 10 kD. La invención también proporciona métodos para producir una fracción activa de un extracto de Cimicifuga que reduce el nivel de un polipéptido de Aß durante el contacto con una célula, que incluyen obtener un extracto de material vegetal de Cimicifuga, extraer el extracto de Cimicifuga con hexano (produciendo de ese modo una fracción soluble en hexano y una fracción insoluble en hexano) y probar la fracción insoluble en hexano para confirmar que la fracción insoluble en hexano reduce el nivel del polipéptido de Aß. Un hexano representativo es el n-hexano. Tales métodos pueden incluir adicionalmente extraer la fracción insoluble en hexano con un dicloroalcano (produciendo una fracción soluble en dicloroalcano y una fracción insoluble en dicloroalcano) donde la fracción soluble en dicloroalcano típicamente reduce el nivel del polipéptido de Aß durante el contacto con una célula. Un dicloroalcano representativo es el dicloruro de metileno. Métodos para producir una fracción activa también pueden incluir extraer la fracción soluble en dicloroalcano con un acetato de alquilo (produciendo una fracción soluble en acetato de alquilo y una fracción insoluble en acetato de alquilo), donde la fracción soluble en acetato de alquilo reduce típicamente el nivel de un polipéptido de Aß. Un acetato de alquilo representativo es el acetato de etilo. Además, los métodos de la invención pueden incluir extraer la fracción soluble en acetato de alquilo con un alcohol (produciendo una fracción soluble en alcohol y una fracción insoluble en alcohol) en donde la fracción soluble en alcohol típicamente reduce el nivel del polipéptido de Aß. Un alcohol representativo es el n-butanol. El producto de cualquiera de las extracciones lo fraccionaciones descritas anteriormente puede concentrarse adicionalmente, por ejemplo, mediante liofilización. También se describe en la presente memoria una composición que contiene una fracción activa de un extracto de Cimicifuga y un portador farmacéuticamente aceptable. Tal fracción activa puede reducir el nivel de un polipéptido de Aß durante el contacto con una célula que produce el polipéptido de Aß. También se describe en la presente memoria un artículo de fabricación que contiene una fracción activa de un extracto de Cimicifuga, un portador farmacéuticamente aceptable y material de envasado. Generalmente, el material de envasado contiene una etiqueta o un prospecto que indica que la composición es eficaz para reducir el nivel de un polipéptido de Aß. A no ser que se defina otra cosa, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente memoria tienen el mismo significado que es conocido comúnmente para un experto normal en la especialidad a la que pertenece... [Seguir leyendo]

1. Un método para reducir el nivel de un polipéptido de ß-amiloide (Aß) en o secretado de una célula in vitro, comprendiendo dicho método poner en contacto dicha célula con una cantidad de un extracto de Cimicifuga o de una fracción activa del mismo eficaz para reducir el nivel de dicho polipéptido de Aß en o secretado de dicha célula y verificar el nivel de dicho polipéptido de Aß en o secretado de dicha célula. 2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho extracto de Cimicifuga o fracción activa del mismo es de C. racemosa. 3. El método de acuerdo con la reivindicación 2, en el que dicho extracto de C. racemosa o fracción activa del mismo se obtiene a partir de la raíz o el rizoma de una planta de C. racemosa. 4. El método de acuerdo con la reivindicación 2, en el que dicho extracto de C. racemosa es un extracto etanólico o un extracto acuoso. 5. El método de acuerdo con la reivindicación 2, en el que un componente activo dentro de dicha fracción activa es soluble en un disolvente seleccionado del grupo que consiste en dicloruro de metileno, acetato de etilo y n-butanol. 6. El método de acuerdo con la reivindicación 5, en el que dicho componente activo es lipófilo. 7. El método de acuerdo con la reivindicación 2, en el que un componente activo dentro de dicha fracción activa tiene un peso molecular de menos de 10 kD. 8. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicha célula se selecciona del grupo que consiste en células H4, células M17, células 293, células de ovario de hámster chino (CHO), fibroblastos primarios, C6, cultivos neuronales primarios, cultivos cerebrales mixtos primarios, Daoy, SK-N-SH, SK-N-AS y SK-N-FI. 9. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicha reducción en el nivel de dicho polipéptido de Aß se debe a una producción disminuida de dicho polipéptido de Aß o un catabolismo incrementado de dicho polipéptido de Aß. 10. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho nivel de dicho polipéptido de Aß se reduce en al menos 10% en comparación con el nivel de dicho polipéptido de Aß en o secretado de una célula correspondiente que no se pone en contacto con dicho extracto o fracción activa del mismo. 11. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho nivel de polipéptido de Aß se reduce en al menos 25% en comparación con el nivel de dicho polipéptido de Aß en o secretado de una célula correspondiente que no se pone en contacto con dicho extracto o fracción activa del mismo. 12. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho nivel de dicho polipéptido de Aß se reduce en al menos 50% en comparación con el nivel de dicho polipéptido de Aß en o secretado de una célula correspondiente que no se pone en contacto con dicho extracto o fracción activa del mismo. 13. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho nivel de dicho polipéptido de Aß se reduce en al menos 80% en comparación con el nivel de dicho polipéptido de Aß en o secretado de una célula correspondiente que no se poen en contacto con dicho extracto o fracción activa del mismo. 14. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho polipéptido de Aß es Aß40. 15. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho polipéptido de Aß es Aß42. 16. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicha reducción es preferente para Aß42. 17. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho extracto o fracción activa del mismo no tiene un efecto significativo sobre el nivel de uno o más de APP, CTF, CTFß o sAPP. 18. Un extracto de Cimicifuga o una fracción activa del mismo para el uso en el tratamiento o la prevención de la enfermedad de Alzheimer en un mamífero. 19. El extracto de Cimicifuga o la fracción activa del mismo de acuerdo con la reivindicación 18, en donde dicho extracto o fracción activa del mismo se administra oralmente, intravenosamente, intracranealmente, intracerebralmente, subcutáneamente, intramuscularmente, intranasalmente o intraperitonealmente. 12 ES 2 367 895 T3 20. El extracto de Cimicifuga o la fracción activa del mismo de acuerdo con la reivindicación 18, en donde dicho mamífero es un roedor. 21. El extracto de Cimicifuga o la fracción activa del mismo de acuerdo con la reivindicación 20, en donde dicho roedor es un ratón. 22. El extracto de Cimicifuga o la fracción activa del mismo de acuerdo con la reivindicación 21, en donde dicho ratón expresa una APP que tiene una mutación sueca. 23. El extracto de Cimicifuga o la fracción activa del mismo de acuerdo con la reivindicación 22, en donde dicho roedor es un ratón Tg2576. 24. Uso de un extracto de Cimicifuga o una fracción activa del mismo para la fabricación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de la enfermedad de Alzheimer. 25. Un método para producir una fracción activa de un extracto de Cimicifuga, en el que dicha fracción activa reduce el nivel de un polipéptido de Aß durante el contacto con una célula que produce dicho polipéptido de Aß, comprendiendo dicho método: obtener un extracto de material vegetal de Cimicifuga; fraccionar por tamaños dicho extracto a través de un filtro para obtener una fracción activa, en donde dicha fracción activa comprende componentes activos que tienen un peso molecular de menos de aproximadamente 10 kD; y probar dicha fracción activa para confirmar que dicha fracción activa reduces el nivel de dicho polipéptido de Aß durante el contacto con dicha célula que produce dicho polipéptido de Aß. 26. Un método para producir una fracción activa de un extracto de Cimicifuga, en el que dicha fracción activa reduce el nivel de un polipéptido de Aß durante el contacto con una célula que produce dicho polipéptido de Aß, comprendiendo dicho método: obtener un extracto de material vegetal de Cimicifuga; extraer dicho extracto de Cimicifuga con hexano, produciendo de ese modo una fracción soluble en hexano y una fracción insoluble en hexano; y probar dicha fracción insoluble en hexano para confirmar que dicha fracción insoluble en hexano reduce el nivel de dicho polipéptido de Aß durante el contacto con dicha célula que produce dicho polipéptido de Aß. 27. El método de acuerdo con la reivindicación 26, en el que dicho hexano es n-hexano. 28. El método de acuerdo con la reivindicación 26, que comprende además: extraer dicha fracción insoluble en hexano con un dicloroalcano, produciendo de ese modo una fracción soluble en dicloroalcano y una fracción insoluble en dicloroalcano, en donde dicha fracción soluble en dicloroalcano reduce en nivel de dicho polipéptido de Aß durante el contacto con dicha célula que produce dicho polipéptido de Aß. 29. El método de acuerdo con la reivindicación 28, en el que dicho dicloroalcano es dicloruro de metileno. 30. El método de acuerdo con la reivindicación 28, que comprende además: extraer dicha fracción soluble en dicloroalcano con un acetato de alquilo, produciendo de ese modo una fracción soluble en acetato de alquilo y una fracción insoluble en acetato de alquilo, en donde dicha fracción soluble en acetato de alquilo reduce el nivel de dicho polipéptido de Aß durante el contacto con dicha célula que produce dicho polipéptido de Aß. 31. El método de acuerdo con la reivindicación 30, en el que dicho acetato de alquilo es acetato de etilo. 32. El método de acuerdo con la reivindicación 30, que comprende además: 13 ES 2 367 895 T3 extraer dicha fracción soluble en acetato de alquilo con un alcohol, produciendo de ese modo una fracción soluble en alcohol y una fracción insoluble en alcohol, en donde dicha fracción soluble en alcohol reduce el nivel de dicho polipéptido de Aß durante el contacto con dicha célula que produce dicho polipéptido de Aß. 33. El método de acuerdo con la reivindicación 32, en el que dicho alcohol es n-butanol. 34. El método de acuerdo con la reivindicación 26, que comprende además concentrar dicho extracto de Cimicifuga antes de dicha extracción con hexano, en el que dicha concentración comprende liofilizar dicho extracto de Cimicifuga. 14