MÉTODOS PARA PRODUCIR POLIPÉPTIDOS SEGREGADOS.

Método para la producción de un polipéptido segregado, comprendiendo:

(a) cultivar una célula huésped fúngica en un medio propicio para la producción del polipéptido, donde la célula huésped fúngica comprende un constructo de ácidos nucléicos comprendiendo una primera secuencia de nucleótidos codificando un péptido señal operativamente enlazado a una segunda secuencia de nucleótidos codificando el polipéptido, donde la primera secuencia de nucleótidos es ajena a la segunda secuencia de nucleótidos, el extremo 3' de la primera secuencia de nucleótidos está inmediatamente corriente arriba del codón iniciador de la segunda secuencia de nucleótidos, y la primera secuencia de nucleótidos se selecciona del grupo que consiste en: (i)una secuencia de nucleótidos codificando un péptido señal comprendiendo la secuencia de aminoácidos de la SEC ID nº: 37; (ii)una secuencia de nucleótidos codificando un péptido señal comprendiendo una secuencia de aminoácidos teniendo al menos un 90% de identidad con la SEC ID nº: 37, y codificando una variante del péptido señal con una secuencia de aminoácidos de la SEC ID nº: 37 comprendiendo una sustitución o deleción de uno o más aminoácidos que no afectan significativamente a la actividad del péptido señal; y (b) aislar el polipéptido segregado a partir del medio de cultivo

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/US2004/013711.

Solicitante: NOVOZYMES, INC..

Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.

Dirección: 1445 DREW AVENUE DAVIS, CA 95616 ESTADOS UNIDOS DE AMERICA.

Inventor/es: FIDANTSEF,ANA, BRODY,HOWARD, MAIYURAN,SUCHINDRA.

Fecha de Publicación: .

Fecha Solicitud PCT: 30 de Abril de 2004.

Fecha Concesión Europea: 18 de Agosto de 2010.

Clasificación Internacional de Patentes:

  • C12N15/80 SECCION C — QUIMICA; METALURGIA.C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN (biocidas, productos que repelen o atraen a los animales nocivos, o reguladores del crecimiento de los vegetales, que contienen microorganismos virus, hongos microscópicos, enzimas, productos de fermentación o sustancias obtenidas por o extraídas de microorganismos o sustancias animales A01N 63/00; preparaciones de uso médico A61K; fertilizantes C05F ); PROPAGACION,CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › para hongos.
  • C12N15/81 C12N 15/00 […] › para levaduras.
  • C12P21/02 C12 […] › C12P PROCESOS DE FERMENTACION O PROCESOS QUE UTILIZAN ENZIMAS PARA LA SINTESIS DE UN COMPUESTO QUIMICO DADO O DE UNA COMPOSICION DADA, O PARA LA SEPARACION DE ISOMEROS OPTICOS A PARTIR DE UNA MEZCLA RACEMICA.C12P 21/00 Preparación de péptidos o de proteínas (proteína monocelular C12N 1/00). › que tienen una secuencia conocida de varios aminoácidos, p. ej. glutation.

Clasificación PCT:

  • C07H21/04 C […] › C07 QUIMICA ORGANICA.C07H AZUCARES; SUS DERIVADOS; NUCLEOSIDOS; NUCLEOTIDOS; ACIDOS NUCLEICOS (derivados de ácidos aldónicos o sacáricos C07C, C07D; ácidos aldónicos, ácidos sacáricos C07C 59/105, C07C 59/285; cianohidrinas C07C 255/16; glicales C07D; compuestos de constitución indeterminada C07G; polisacáridos, sus derivados C08B; ADN o ARN concerniente a la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos o su aislamiento, preparación o purificación C12N 15/00; industria del azúcar C13). › C07H 21/00 Compuestos que contienen al menos dos unidades mononucleótido que tienen cada una grupos fosfato o polifosfato distintos unidos a los radicales sacárido de los grupos nucleósido, p. ej. ácidos nucleicos. › con desoxirribosilo como radical sacárido.
  • C12N15/00 C12N […] › Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K).
  • C12N15/63 C12N 15/00 […] › Introducción de material genético extraño utilizando vectores; Vectores; Utilización de huéspedes para ello; Regulación de la expresión.
  • C12N15/80 C12N 15/00 […] › para hongos.

Clasificación antigua:

  • C07H21/04 C07H 21/00 […] › con desoxirribosilo como radical sacárido.
  • C12N15/00 C12N […] › Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K).
  • C12N15/63 C12N 15/00 […] › Introducción de material genético extraño utilizando vectores; Vectores; Utilización de huéspedes para ello; Regulación de la expresión.
  • C12N15/80 C12N 15/00 […] › para hongos.

Países PCT: Austria, Bélgica, Suiza, Alemania, Dinamarca, España, Francia, Reino Unido, Grecia, Italia, Liechtensein, Luxemburgo, Países Bajos, Suecia, Mónaco, Portugal, Irlanda, Eslovenia, Finlandia, Rumania, Chipre.


Fragmento de la descripción:

Métodos para producir polipéptidos segregados.

Escrito en cuanto a Derechos para Invenciones Hechas Bajo Investigación y Desarrollo Patrocinados Federalmente

Esta invención se hizo con el apoyo del Gobierno bajo el subcontrato NREL nº. ZCO-30017-02, Contrato Preferente DE-AC36-98GO10337 otorgado por el Departamento de Energía. El gobierno tiene derechos determinados sobre esta invención.

Antecedentes de la invención

Campo de la invención

La presente invención se refiere a métodos para producir polipéptidos segregados.

Descripción de las técnicas relacionadas

La producción recombinante de una proteína heteróloga en una célula huésped fúngica, particularmente una célula micótica filamentosa tal como Aspergillus o una célula de levadura tal Saccharomyces, puede proporcionar un vehículo más deseable para producir la proteína en cantidades comercialmente pertinentes.

La producción recombinante de una proteína heteróloga se realiza generalmente construyendo un cassette de expresión en el cual la codificación de ADN para la proteína se coloca bajo el control de la expresión de un promotor, extirpado de un gen regulado, adecuado para la célula huésped. El cassette de expresión se introduce en la célula huésped, normalmente por transformación mediada por plásmidos. La producción de la proteína heteróloga se consigue entonces por cultivo de la célula huésped transformada bajo condiciones inductoras necesarias para el funcionamiento apropiado del promotor contenido en el cassette de expresión.

La mejora de la producción recombinante de proteínas requiere generalmente la disponibilidad de secuencias reguladoras nuevas las cuales son adecuadas controlando la expresión de las proteínas en una célula huésped.

La patente estadounidense. Nº. 6.015.703 expone constructos genéticos comprendiendo un promotor, una señal de secreción de xilanasa, y una región de codificación de beta-glucosidasa madura. Los constructos descritos, expresados en microbios recombinantes, aumentan espectacularmente la cantidad de beta-glucosidasa producida en relación a los microbios no transformados.

WO 91/17243 expone una endoglucanasa V y su gen a partir de Humicola insolens DSM 1800.

Es un objetivo de la presente invención proporcionar métodos mejorados para producir un polipéptido en una célula huésped fúngica usando secuencias de péptido señal.

Resumen de la invención

La presente invención se refiere a métodos para producir un polipéptido segregado, comprendiendo:

(a) cultivar una célula huésped fúngica en un medio propicio para la producción del polipéptido, donde la célula huésped fúngica comprende un constructo de ácidos nucleicos comprendiendo una primera secuencia de nucleótidos codificando un péptido señal operativamente enlazado a una segunda secuencia de nucleótidos codificando el polipéptido, donde la primera secuencia de nucleótidos es ajena a la segunda secuencia de nucleótidos, el extremo 3' de la primera secuencia de nucleótidos está situado inmediatamente corriente arriba del codón iniciador de la segunda secuencia de nucleótidos, y la primera secuencia de nucleótidos se selecciona del grupo que consiste en:

(i)una secuencia de nucleótidos codificando un péptido señal comprendiendo la secuencia de aminoácidos de la SEC ID nº: 37; (ii)una secuencia de nucleótidos codificando un péptido señal comprendiendo una secuencia de aminoácidos teniendo al menos un 90% de identidad con la SEC ID nº: 37, y codificando una variante del péptido señal teniendo una secuencia de aminoácidos de la SEC ID No: 37 comprendiendo una sustitución o deleción de uno o más aminoácidos que no afectan significativamente a la actividad del péptido señal; y (b) aislar el polipéptido segregado del medio de cultivo.

Breve descripción de las figuras

Figura 1 muestra un mapa de restricción de pAlLo1.

Figura 2 muestra un mapa de restricción de pMJ04.

Figura 3 muestra un mapa de restricción de pCaHj527.

Figura 4 muestra un mapa de restricción de pMT2188.

Figura 5 muestra un mapa de restricción de pCaHj568.

Figura 6 muestra un mapa de restricción de pMJ05.

Figura 7 muestra un mapa de restricción de pSMai130.

Figura 8 muestra la secuencia de ADN (SEC ID nº: 34) y la secuencia de aminoácidos deducida (SEC ID nº: 35) de la secuencia señal de secreción de una beta-glucosidasa de Aspergillus oryzae.

Figura 9 muestra la secuencia de ADN (SEC ID nº: 36) y la secuencia de aminoácidos deducida (SEC ID nº: 37) de la secuencia señal de secreción de una endoglucanasa V de Humicola insolens.

Figura 10 muestra un mapa de restricción de pSMai135.

Figura 11 muestra un mapa de restricción de pSATe101.

Figura 12 muestra un mapa de restricción de pSATe111.

Figura 13 muestra un mapa de restricción de pALFd1.

Figura 14 muestra un mapa de restricción de pAlLo2.

Figura 15 muestra un mapa de restricción de pEJG97.

Figura 16 muestra la secuencia de ADN genómico y la secuencia de aminoácidos deducida de una beta-glucosidasa de Aspergillus fumigatus (SEC ID Nos: 46 y 47, respectivamente). El péptido señal anteriormente citado está subrayado y los intrones anteriormente citado están en letra itálica.

Figura 17 muestra un mapa de restricción de pCR4BIunt-TOPOAfcDNA5'.

Figura 18 muestra un mapa de restricción de pCR4Blunt-TOPOAfcDNA3'.

Figura 19 muestra un mapa de restricción de pCR4Blunt-TOPOAfcDNA.

Figura 20 muestra un mapa de restricción de pALFd7.

Figura 21 muestra un mapa de restricción de pALFd6.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere a métodos para producir un polipéptido, comprendiendo: (a) cultivar una célula huésped fúngica en un medio propicio para la producción del polipéptido, donde la célula huésped fúngica comprende un constructo de ácidos nucléicos comprendiendo una primera secuencia de nucleótidos codificando un péptido señal operativamente enlazado a una segunda secuencia de nucleótidos codificando el polipéptido, donde la primera secuencia de nucleótidos es ajena a la segunda secuencia de nucleótidos y el extremo 3' de la primera secuencia de nucleótidos está situada inmediatamente corriente arriba del codón iniciador de la segunda secuencia de nucleótidos, donde la primera secuencia de nucleótidos se selecciona del grupo que consiste en: (i) una secuencia de nucleótidos codificando un péptido señal comprendiendo la secuencia de aminoácidos de la SEC ID nº: 37 y (ii) una secuencia de nucleótidos codificando un péptido señal comprendiendo una secuencia de aminoácidos teniendo al menos un 90% de identidad con la SEC ID nº: 37, y codificando una variante del péptido señal con una secuencia de aminoácidos de la SEC ID No: 37 comprendiendo una sustitución o deleción de uno o más aminoácidos que no afectan significativamente a la actividad del péptido señal; y (b) aislar el polipéptido segregado del medio de cultivo.

En los métodos de producción de la presente invención, las células huésped fúngicas se cultivan en un medio nutritivo adecuado para la producción del polipéptido usando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, la célula se puede cultivar por cultivo en matraz de agitación, o fermentación a gran escala o a pequeña escala (incluyendo las fermentaciones continua, en lote, en flujo discontinuo, o en estado sólido) en laboratorio o en fermentadores industriales realizado en un medio adecuado y bajo condiciones permitiendo al polipéptido expresarse y/o aislarse. El cultivo se desarrolla en un medio nutritivo adecuado comprendiendo fuentes de nitrógeno y carbono y sales inorgánicas, usando procedimientos conocidos en la técnica. Medios adecuados están disponibles a través de proveedores comerciales o se pueden preparar según composiciones publicadas (p. ej., en catálogos de la American Type Culture Collection).

Los...

 


Reivindicaciones:

1. Método para la producción de un polipéptido segregado, comprendiendo:

(a) cultivar una célula huésped fúngica en un medio propicio para la producción del polipéptido, donde la célula huésped fúngica comprende un constructo de ácidos nucléicos comprendiendo una primera secuencia de nucleótidos codificando un péptido señal operativamente enlazado a una segunda secuencia de nucleótidos codificando el polipéptido, donde la primera secuencia de nucleótidos es ajena a la segunda secuencia de nucleótidos, el extremo 3' de la primera secuencia de nucleótidos está inmediatamente corriente arriba del codón iniciador de la segunda secuencia de nucleótidos, y la primera secuencia de nucleótidos se selecciona del grupo que consiste en:

(i)una secuencia de nucleótidos codificando un péptido señal comprendiendo la secuencia de aminoácidos de la SEC ID nº: 37; (ii)una secuencia de nucleótidos codificando un péptido señal comprendiendo una secuencia de aminoácidos teniendo al menos un 90% de identidad con la SEC ID nº: 37, y codificando una variante del péptido señal con una secuencia de aminoácidos de la SEC ID nº: 37 comprendiendo una sustitución o deleción de uno o más aminoácidos que no afectan significativamente a la actividad del péptido señal; y (b) aislar el polipéptido segregado a partir del medio de cultivo.

2. Método según la reivindicación 1, donde la primera secuencia de nucleótidos codifica un péptido señal que consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEC ID nº: 37, o un fragmento peptídico de la misma que retiene la capacidad para dirigir el polipéptido dentro de una vía secretora de la célula.

3. Método según la reivindicación 1, donde la primera secuencia de nucleótidos consiste en la SEC ID nº: 36, o una subsecuencia de la misma la cual codifica un péptido señal que retiene la capacidad para dirigir el polipéptido dentro de una vía secretora de la célula.

4. Método según la reivindicación 1, donde la primera secuencia de nucleótidos está contenida en un gen de endoglucanasa V el cual está contenido en la cepa DSM 1800 de Humicola insolens.

5. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, donde la segunda secuencia de nucleótidos codifica un polipéptido heterólogo o nativo a la célula huésped fúngica.

6. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-5, donde la célula huésped fúngica contiene una o más copias de la segunda secuencia de nucleótidos.

7. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, donde el polipéptido es una hormona o variante de hormona, enzima, receptor o parte del mismo, anticuerpo o parte del mismo, o indicador.

8. Método según la reivindicación 7, donde la enzima es una oxidorreductasa, transferasa, hidrolasa, liasa, isomerasa, o ligasa.

9. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-8, donde la enzima es una endoglucanasa, celobiohidrolasa, o beta-glucosidasa.

10. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-9, donde el polipéptido es una beta-glucosidasa.

11. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-10, donde la célula huésped fúngica es una célula fúngica filamentosa o de levadura.

12. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-11, donde el constructo de ácidos nucleicos comprende además un promotor operativamente enlazado a las secuencias de nucleótidos primera y segunda.

13. Método según la reivindicación 12, donde el promotor se selecciona a partir del grupo que consiste en un promotor del gen de celobiohidrolasa I de Trichoderma reesei, promotor del gen de celobiohidrolasa II de Trichoderma reesei, promotor del gen de xilanasa I de Trichoderma reesei, promotor del gen de xilanasa II de Trichoderma reesei, y promotor del gen de beta-xilosidasa de Trichoderma reesei.


 

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