MÉTODOS PARA GENERAR RESISTENCIA FRENTE A CGMMV EN PLANTAS.

Métodos para generar resistencia frente a CGMMV en plantas. La presente invención se refiere a un método para generar resistencia frente al virus del mosaico moteado verde del pepino (CGMMV) en plantas, en particular en plantas que son susceptibles a la infección por CGMMV, tales como especies de la familia Cucurbitaceae. La invención se refiere además a constructos genéticos adecuados para su uso en dicho método, y a plantas transgénicas resistentes a CGMMV obtenidas mediante dicho método. Se han conocido durante muchos años métodos de introducción de secuencias de ADN en el genoma de plantas y se han usado ampliamente para alterar las propiedades de variedades de plantas. Tales métodos son entre otros la transformación mediada por Agrobacterium (Horsch et al., 1985; Rogers et al., 1986), la transformación de protoplastos usando electroporación u otras técnicas para introducir moléculas de ADN desnudo en la célula vegetal (Shillito et al. 1985) y bombardeo de partículas para introducir moléculas de ADN desnudo en tejidos o células vegetales (Christou et al., 1994). Entre las aplicaciones más importantes de la ingeniería genética de plantas están las que tienen como objetivo introducir genes de resistencia en una amplia variedad de patógenos de plantas y plagas de plantas, tales como bacterias, hongos, nematodos, insectos y virus. Muchos ejemplos de resistencia a virus en una amplia variedad de especies de plantas se han descrito a lo largo de las últimas décadas (Wilson et al., 1993). Los diversos métodos para obtener resistencia a virus en plantas a través de la introducción de secuencias génicas se basan o bien en el uso de genes de origen vegetal; en el uso de secuencias/genes derivados del propio patógeno viral (la denominada resistencia derivada de patógenos (Wilson et al., 1993), o bien en el uso de genes de origen aún diferente. Las secuencias que se originan a partir del genoma viral pueden ser secuencias de ADN o bien amplificadas por PCR o bien clonadas obtenidas del genoma de virus de ADN, tales como geminivirus (Kunik et al., 1994) o las secuencias de ADNc obtenidas de los genomas de virus de ARN a través del uso de clonación de ADNc o amplificación por RT­ PCR. Los ejemplos de secuencias/genes de virus de ARN que se han usado satisfactoriamente en el diseño por ingeniería genética de resistencia a virus en plantas incluyen: 1. genes de proteína de cubierta de tobamovirus, cucumovirus, potivirus, potexvirus (Beachy et al., 1990); 2. genes de ARN polimerasa dependiente de ARN (genes de replicasa) de tobamovirus, cucumovirus, potivirus (Anderson et al., 1992; Donson et al., 1993; Audy et al., 1994); 3. genes de nucleoproteína de tospovirus (Goldbach y De Haan, 1993; Prins et al., 1994; Vaira et al., 1995); 4. genes de proteínas de movimiento de tobamovirus y cucumovirus (Cooper et al., 1995). El virus del mosaico moteado verde del pepino (CGMMV) es un miembro del grupo de tobamovirus e infecta especies de plantas de la familia Cucurbitaceae: melón (Cucumis melo), pepino (C. sativus), sandía (Citrullus vulgaris) y calabaza de peregrino (Lagenaria siceraria), pero no aparentemente Cucurbita pepo (zapallo, calabaza común, calabacín). El intervalo de huésped del virus se restringe básicamente a miembros de las Cucurbitaceae y/o las especies de diagnóstico Datura stramonium y Chenopodium amaranticolor (Hollings et al., 1975). Pueden distinguirse varias cepas diferentes serológicamente y por su respuesta en C. amaranticolor y D. stramonium (Hollings et al., 1975). La cepa tipo se identificó originalmente en Europa y no provoca normalmente síntomas en el fruto en el pepino. Otra cepa europea, denominada la cepa del mosaico aucuba del pepino, virus 4 del pepino o virus 2A de Cucumis provoca síntomas en el fruto en el pepino. Se conocen varias cepas del Japón. En sandía, la cepa de sandía provoca una enfermedad grave, mientras que la cepa del pepino japonés (también denominada virus del mosaico moteado verde Kyuri) y la cepa Yodo provocan alteraciones en la fruta en el pepino. La cepa CGMMV-C de la India es un patógeno en la calabaza de peregrino e infecciones graves pueden provocar pérdidas de cosechas completas. En pepino, CGMMV provoca aclaramiento de las venas, un moteado de las hojas de color verde claro a oscuro, formación de ampollas en las hojas y malformación y crecimiento atrofiado, lo que afecta gravemente al rendimiento de frutos. El aislado del este de Europa de la cepa del mosaico aucuba produce un moteado de las hojas de color amarillo brillante y alteración del color del fruto. CGMMV se transmite a través de la semilla, lo más probablemente a través de infección mecánica por medio de las raíces en suelo contaminado, y a través de contacto con el follaje y manipulación de plantas (Hollings et al., 1975). Las partículas de virus son extremadamente estables y sobreviven varios meses a temperaturas normales. Esta 2 ES 2 367 866 T3 estabilidad, combinada con la muy alta infectividad a través de contacto mecánico del follaje, es responsable de la importancia económica del virus, ya que incluso una o unas pocas plantas infectadas en un invernadero de pepinos pueden provocar en última instancia la infección y la pérdida de la cosecha total. Además, la infección puede no sólo propagarse rápidamente por una cosecha actual, sino también, debido a la fuerte persistencia del virus, afectar a 5 cosechas posteriores. Por tanto, una infección por CGMMV puede requerir la esterilización de todo un invernadero, así como el uso de herramientas y materiales estériles. Se ha determinado la secuencia completa de sólo un aislado de CGMMV (Ugaki et al., 1991; números de registro de Genbank D12505 y D01188). Este aislado SH se había encontrado en plantas de sandía infectadas en el este de 10 Asia. Además, se conoce la secuencia del gen de proteína de cubierta de otro aislado (W) obtenido de sandía infectada (Meshi et al., 1983; números de registro de Genbank V01551 y J02054), así como la secuencia del gen de proteína de movimiento de 29 kD de una cepa de sandía (Saito et al., 1988; número de registro de Genbank J04332). La secuencia de nucleótidos del aislado CGMMV-SH muestra una identidad del 55 al 56% con el virus del mosaico del tabaco (TMV) y el virus del mosaico verde atenuado del tabaco (TMGMV), ambos miembros del grupo 15 de tobamovirus (Ugaki et al., 1991). Tal como se describe por Ukagi et al., el genoma de CGMMV consiste en una molécula de ARN monocatenario que codifica para al menos cuatro marcos de lectura abiertos, que codifican para proteínas supuestas de 186 kD, 129 kD, 29 kD y 17,3 kD, de las cuales el ORF de 17,3 se sabe que codifica para la proteína de cubierta. En este 20 sentido, Ugaki et al. establecen: No se han identificado aún in vivo proteínas codificadas por CGMMV excepto la proteína de cubierta. El genoma de CGMMV se muestra esquemáticamente en la figura 1. Tal como puede observarse en la misma, el ORF que codifica para la proteína de 186 kD comienza en el mismo sitio que el ORF que codifica para la proteína de 25 129 kD, y se añade un supuesto polipéptido de 57 kD al ORF de 129 kD. La presencia de esta proteína de 57 kD sola no se ha detectado en plantas infectadas. En su lugar, se ha encontrado la proteína de 186 kD, que es el producto de una traducción de ultralectura de las ORF de 129 kD y 57 kD. Se cree que esta proteína de 186 kD desempeña un papel en la replicación del virus. Además, se cree que el ORF 30 de 129 kD codifica para una función replicasa, mientras que el ORF de 29 kD codifica para una proteína de movimiento. A continuación en el presente documento, la secuencia de nucleótidos que corresponde al ORF que codifica para la proteína de 129 kD se denominará secuencia de 129 kD, la secuencia que corresponde a la proteína de 35 ultralectura de 186 kD se denominará secuencia de 186 kD y la secuencia de nucleótidos que corresponde al ORF que codifica para la parte de ultralectura de 57 kD se denominará secuencia de 57 kD. Estas secuencias de nucleótidos y las secuencias de proteína correspondientes se facilitan en las listas de secuencias, tal como se describe adicionalmente a continuación. 40 El objeto de la invención era proporcionar un método para proteger plantas, en particular plantas susceptibles a la infección con CGMMV tales como especies de la familia Cucurbitaceae, frente a la infección con CGMMV, y en particular frente a la infección con cepas de CGMMV prevalentes en Europa, tales como las cepas encontradas en el cultivo de pepinos en invernaderos. 45 Objetos adicionales eran proporcionar medios para su uso en dicho método, en particular un constructo genético que puede usarse para transformar plantas o material vegetal de modo que se proporcionen plantas transgénicas resistentes frente a la infección con CGMMV. Objetos adicionales de la invención... [Seguir leyendo]

1. Método para generar resistencia en una planta o en una célula vegetal frente a la infección con el virus del mosaico moteado verde del pepino (CGMMV), comprendiendo dicho método transformar dicha planta o célula vegetal con una secuencia de polinucleótido que - tras su transcripción en ARN genera resistencia frente a la infección con CGMMV en dicha planta; - tras su transcripción en ARN no conduce a la generación de actividad replicasa en dicha planta; y - en el que la secuencia de polinucleótido comprende un promotor, operativamente unido a una primera y una segunda secuencia de ADN que están presentes en una repetición invertida, en la que: la primera secuencia de ADN comprende una primera región de ADN que puede transcribirse en una molécula de ARN homosentido con una secuencia de nucleótidos que comprende una secuencia de nucleótidos homosentido de al menos 100 nucleótidos consecutivos que tiene una identidad de secuencia de entre el 90 y el 100% con la secuencia de nucleótidos que codifica para la replicasa del CGMMV que puede infectar a la planta o la célula vegetal; y dicha primera secuencia de ADN comprende además opcionalmente una región de ADN implicada en la terminación de la transcripción y el funcionamiento de poliadenilación en células vegetales; la segunda secuencia de ADN comprende una segunda región de ADN que puede transcribirse en una molécula de ARN antisentido con una secuencia de nucleótidos que comprende una secuencia de nucleótidos antisentido que incluye al menos 100 nucleótidos consecutivos, que tiene una identidad de secuencia de entre aproximadamente el 90% y aproximadamente el 100% con el complemento inverso de los al menos 100 nucleótidos consecutivos de la secuencia de nucleótidos homosentido; y dicha segunda secuencia de ADN comprende además opcionalmente una región de ADN implicada en la terminación de la transcripción y el funcionamiento de poliadenilación en células vegetales en la que la primera y segunda región de ADN están unidas por una secuencia de nucleótidos espaciadora; y en la que las moléculas de ARN homosentido y antisentido pueden formar un ARN en horquilla mediante apareamiento de bases entre las regiones que son complementarias. 2. Método según la reivindicación 1, en el que la secuencia de nucleótidos que codifica para la replicasa del CGMMV es: - la secuencia de nucleótidos que corresponde a la secuencia facilitada en SEQ ID no.1, a la secuencia facilitada en SEQ ID no.17 o a la secuencia de nucleótidos de una variante de las mismas que se produce de manera natural; - la secuencia de nucleótidos que corresponde a la secuencia facilitada en SEQ ID no.5, a la secuencia facilitada en SEQ ID no.21, o a la secuencia de nucleótidos de una variante de las mismas que se produce de manera natural; - la secuencia de nucleótidos que corresponde a la secuencia facilitada en SEQ ID no.3, a la secuencia facilitada en SEQ ID no.19 o a la secuencia de nucleótidos de una variante de las mismas que se produce de manera natural 3. Método según la reivindicación 2, en el que la secuencia de nucleótidos que codifica para la replicasa del CGMMV es la secuencia de nucleótidos que corresponde a la secuencia facilitada en SEQ ID no.1, a la secuencia facilitada en SEQ ID no.17 o a la secuencia de nucleótidos de una variante de las mismas que se produce de manera natural. 4. Método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la secuencia de nucleótidos espaciadora comprende un intrón. 5. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además al menos una etapa de cultivar la célula vegetal transformada para dar una planta madura. 6. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además al menos una etapa de reproducir o multiplicar sexual o asexualmente la planta transformada y/o la planta madura obtenida a partir de la célula vegetal transformada según la reivindicación 5. 79 ES 2 367 866 T3 7. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la planta es una planta que es susceptible a la infección con CGMMV, más preferiblemente una planta que pertenece a la familia Cucurbitaceae, tal como melón (Cucumis melo), pepino (C. sativus), sandía (Citrullus vulgaris) y calabaza de peregrino (Lagenaria siceraria). 8. Constructo genético adecuado para transformar una planta, comprendiendo dicho constructo al menos una secuencia de nucleótidos que - tras su transcripción en ARN genera resistencia frente a la infección con CGMMV en dicha planta; y - tras su transcripción en ARN no conduce a la generación de actividad replicasa en dicha planta; y que comprende opcionalmente elementos adicionales de constructos genéticos conocidos per se; comprendiendo dicha secuencia de nucleótidos un promotor, operativamente unido a una primera secuencia de ADN y una segunda secuencia de ADN que están presentes en una repetición invertida, comprendiendo dicha primera secuencia de ADN una primera región de ADN que puede transcribirse en una molécula de ARN homosentido con una secuencia de nucleótidos que comprende una secuencia de nucleótidos homosentido de al menos 100 nucleótidos consecutivos que tiene una identidad de secuencia de entre el 90 y el 100% con la secuencia de nucleótidos que codifica para la replicasa del CGMMV que puede infectar a la planta o la célula vegetal; y comprendiendo dicha segunda secuencia de ADN una segunda región de ADN que puede transcribirse en una molécula de ARN antisentido con una secuencia de nucleótidos que comprende una secuencia de nucleótidos antisentido que incluye al menos 100 nucleótidos consecutivos, que tiene una identidad de secuencia de entre aproximadamente el 90% y aproximadamente el 100% con el complemento inverso de los al menos 100 nucleótidos consecutivos de la secuencia de nucleótidos homosentido, en el que la primera y segunda región de ADN están unidas por una secuencia de nucleótidos espaciadora; comprendiendo además opcionalmente dicha secuencia de nucleótidos una región de ADN implicada en la terminación de la transcripción y el funcionamiento de poliadenilación en células vegetales, en el que las moléculas de ARN homosentido y antisentido pueden formar un ARN en horquilla. 9. Constructo genético según la reivindicación 8, en el que la secuencia de nucleótidos que codifica para la replicasa del CGMMV es: - la secuencia de nucleótidos que corresponde a la secuencia facilitada en SEQ ID no.1, a la secuencia facilitada en SEQ ID no.17 o a la secuencia de nucleótidos de una variante de las mismas que se produce de manera natural; - la secuencia de nucleótidos que corresponde a la secuencia facilitada en SEQ ID no.5, a la secuencia facilitada en SEQ ID no.21, o a la secuencia de nucleótidos de una variante de las mismas que se produce de manera natural; - la secuencia de nucleótidos que corresponde a la secuencia facilitada en SEQ ID no.3, a la secuencia facilitada en SEQ ID no.19 o a la secuencia de nucleótidos de una variante de las mismas que se produce de manera natural. 10. Constructo genético según cualquiera de las reivindicaciones 8-9, en el que la secuencia de nucleótidos está bajo el control del promotor de plastocianina. 11. Constructo genético según cualquiera de las reivindicaciones 8-10, en el que la secuencia de nucleótidos está precedida por la secuencia líder (5-UTR) de CGMMV nativa. 12. Constructo genético según cualquiera de las reivindicaciones 8-11 en una forma que puede mantenerse o heredarse de manera estable en un microorganismo, en particular una bacteria, más en particular una bacteria que puede usarse para transformar una planta o material vegetal, tal como Agrobacterium. 13. Microorganismo, en particular bacteria, más en particular una bacteria que puede usarse para transformar una planta, tal como Agrobacterium, que contiene un constructo genético según cualquiera de las reivindicaciones 8-12. 14. Planta transgénica o célula vegetal, que puede obtenerse o que se obtiene mediante un método según una de las reivindicaciones 1-7, o un descendiente transgénico de una planta de este tipo. 15. Planta, célula vegetal o material vegetal que se ha transformado con el constructo genético según cualquiera de las reivindicaciones 8-12, o un descendiente transgénico de una planta de este tipo. 16. Planta según la reivindicación 14 ó 15, que es una planta susceptible a la infección con CGMMV, más preferiblemente una planta que pertenece a la familia Cucurbitaceae, tal como melón (Cucumis melo), pepino (C. sativus), sandía (Citrullus vulgaris) y calabaza de peregrino (Lagenaria siceraria). 17. Material de cultivo tal como semilla, tubérculos, raíces, tallos, plántulas que comprende el constructo genético según una cualquiera de las reivindicaciones 8-12 para una planta según la reivindicación 14, 15 ó 16. nucleótidos ES 2 367 866 T3 81 Caja GDD Proteína de 186k Proteína de 129k Líder ORF de 57 kD ES 2 367 866 T3 82 ES 2 367 866 T3 83 pb Motivo GDD Rep. De 54 kDa Líder de CGMMV ES 2 367 866 T3 84 pb Bucle P Parte no codificante de 129 kDa Rep. de 129 kDa modificada Líder de CGMMV Codón de terminación Motivo GDD ES 2 367 866 T3 pb No codificante Codones de terminación Bucle P Motivo GDD Motivo GDD Líder de CGMMV 129 kDa modificada ES 2 367 866 T3 86 pb Motivo GDD Rep. De 54 kDa Líder de CGMMV ES 2 367 866 T3 87 pb Líder de CGMMV Bucle P Parte no codificante de 129 kDa Codón de terminación Rep. de 129 kDa modificada Motivo GDD ES 2 367 866 T3 88 pb No codificante Codones de terminación Bucle P Líder de CGMMV Rep. de 129 kDa modificada Motivo GDD Vector de transformación ES 2 367 866 T3 89 Repetición invertida ES 2 367 866 T3 Intrón AO3 Homosentido Intrón IV2 Homosentido ES 2 367 866 T3 91 pb Repetición Repetición Fragmento de CGMMV de 129 kD Fragmento de CGMMV de 129 kD ES 2 367 866 T3 92 pb Repetición Repetición Fragmento de CGMMV de 129 kD Motivo GDD Motivo GDD Fragmento de CGMMV de 129 kD Fragmento de CGMMV Fragmento de CGMMV Intrón ao3 Repetición Repetición ES 2 367 866 T3 93 pb Fragmento de CGMMV de 129 kD Intrón ao3 Motivo GDD Fragmento de CGMMV de 129 kD Repetición ES 2 367 866 T3 Repetición 94 pb Fragmentos de CGMMV de 129 kD Repetición ES 2 367 866 T3 Repetición Intrón LS1 pb Fragmento de CGMMV de 129 kD Motivo GDD Intrón LS1 Motivo GDD Fragmento de CGMMV de 129 kD Repetición ES 2 367 866 T3 Repetición 96 pb