METODO PARA LA DETECCION Y CUANTIFICACION SELECTIVA DE PALITOXINAS MEDIANTE SUS EFECTOS TOXICOS SOBRE CELULAS EXCITABLES.

Método para la detección y cuantificación selectiva de palitoxinas mediante sus efectos tóxicos sobre células excitables.

La presente invención se refiere a un método para la detección y cuantificación sistemática de palitoxina y sus derivados (PLTXs) en muestras problema mediante la utilización de células excitables y un inhibidor selectivo de la citotoxicidad de las PLTXs. La adición a las células de muestras problema contaminadas con PLTXs disminuye la viabilidad celular de forma proporcional a la concentración de PLTXs existente en la muestra. La presencia del inhibidor de la toxicidad de las PLTXs durante la exposición de las células a muestras problema contaminadas con PLTXs previene específicamente su toxicidad. La comparación de los niveles de supervivencia de células tratadas con la muestra contaminada con PLTXs respecto a los valores obtenidos en cultivos tratados con concentraciones variables de PLTX purificada permite determinar la concentración de PLTXs presente en lamuestra problema

Método para la detección y cuantificación selectiva de palitoxinas mediante sus efectos tóxicos sobre células excitables.

La presente invención se refiere a un método para la detección y cuantificación sistemática de la presencia de palitoxina y sus derivados (PLTXs) en muestras problema, como extractos de alimentos marinos o muestras de aguas, mediante la utilización de células excitables y el uso de un inhibidor selectivo de la citotoxicidad de las PLTXs.

Las PLTXs, unas ficotoxinas particularmente potentes y letales, son retenidas y acumuladas por diversos organismos marinos, en particular por moluscos de habitual consumo, en sus tejidos sin que se aprecien cambios en su morfología o viabilidad, por lo que se hace necesario el desarrollo de métodos rápidos, sensibles y específicos para su detección y cuantificación.

La invención resulta de aplicación en aquellos sectores que precisen de la detección, identificación y cuantificación de sustancias químicas y bioquímicas de carácter tóxico en seres vivos, como por ejemplo en los sectores medioambiental o agroalimentario, y en particular en el campo de la seguridad alimentaria de productos marinos.

Estado de la técnica

Durante los últimos años, los dinoflagelados productores de PLTXs ha demostrado tener una distribución mundial, haciendo de esta toxina un riesgo grave y real para la salud. Por ello, resulta imprescindible controlar sistemáticamente los niveles de PLTXs contenidos en los alimentos antes de autorizar su salida al mercado. En la actualidad, el método de detección de toxinas universalmente aceptado es el bioensayo del ratón (Yasumoto T., Oshima Y., Sugawara M., Fukuyo Y., Oguri H., Igarashi T., Fujita N. (1980) Bull Japan Soc Sci Fish. 46: 1405-1411) que se basa en la observación de los efectos producidos tras la inyección intraperitoneal de extractos de hepatopáncreas de moluscos en ratones.

Este bioensayo es de sencilla realización y ha resultado de gran utilidad para determinar si el producto es apto o no para el consumo humano. Sin embargo, cuenta con grandes inconvenientes:

- Económicos: Es un procedimiento costoso.

- Baja sensibilidad: los resultados obtenidos llevan implícito un gran margen de error.

- Falta de especificidad: no permite obtener información precisa de la naturaleza del agente tóxico.

- Elevada variabilidad: los resultados obtenidos pueden variar para el mismo extracto de marisco contaminado.

- Éticos: requiere el empleo masivo de animales de laboratorio.

Estos inconvenientes han favorecido la búsqueda de alternativas que, a pesar de sus múltiples ventajas, entre las que destacan una mayor sensibilidad a concentraciones más bajas de toxina y menos variabilidad en los resultados obtenidos, también presentan inconvenientes.

Así, los bioensayos de toxicidad en líneas celulares desarrollados hasta ahora (Bellocci M., Ronzitti G., Milandri A., Melchiorre N., Grillo C., Poletti R., Yasumoto T., Rossini GP. (2008) Anal Biochem. 374 (1): 48-55; Espina B., Cagide E., Louzano MC., Martinez-Fernandez M., Vieytes MR., Katikou P., Villar A., Jaen D., Maman L., Botana LM. (2009) Biosci Rep. 29 (1): 13-23; Tan CH., Teh YF. (1972) Experientia. 28: 46) o la medida de la actividad hemolítica de la PLTX (Bignami GS. (1993) Toxicon. 31 (6): 817-820; Riobó P., Paz B., Franco JM., Vázquez JA., Murado MA., Cacho E. (2008) Food Chem Toxicol. 46 (8):2639-2647), no resultan sensibles a todas las toxinas conocidas hasta el momento y poseen una elevada variabilidad relacionada con la naturaleza tumoral de las líneas celulares utilizadas o, en el caso de las hematíes, con la especie animal de la que se aíslan.

Los radioinmunoensayos (Levine L., Fujiki H., Gjika HB., Van Vunakis H. (1988) Toxicon. 26: 115-1121), a pesar de su especificidad, tienden a ser reemplazados por métodos no radiactivos por motivos de seguridad, mientras que los ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas (ELISAs) (Bignami GS., Raybould TJ., Sachinvala ND., Grothaus PG., Simpson SB., Lazo CB., Byrnes JB., Moore RE., Vann DC. (1992) Toxicon. 30 (7): 687-700), aunque son sensibles y relativamente rápidos en la detección, no discriminan entre formas biológicamente activas y no activas.

Por otro lado, recientemente se han desarrollado nuevos métodos físico-químicos, entre los que destaca la cromatografia líquida en fase reversa con espectrometría de masas (LC-ESI-MS/MS) (Cimiello P., Dell' Aversano C., Fattorusso E., Forino M., Magno GS., Tartaglione L., Grillo C., Melchiorre N. (2006) Anal Chem. 78 (17): 6153-6159). Dicho método posee un gran potencial por su rapidez, sensibilidad e inequívoca identificación de la PLTX en extractos contaminados. Sin embargo, este tipo de procedimientos requieren de un equipamiento costoso, complejo y, en muchos de los casos, de personal especializado. Ademas, sólo permiten cuantificar toxinas conocidas de las que estén disponibles patrones purificados, lo cual no siempre está asegurado.

Descripción de la invención

El método propuesto en el presente documento se basa en primer lugar en que la exposición de los cultivos de células excitables a concentraciones crecientes de PLTXs da lugar a una disminución de su viabilidad, mientras que el pretratamiento con un inhibidor de la permeabilidad iónica celular o con una molécula con grupos isotiocianato previene la degeneración y muerte celular inducida por las PLTXs. En segundo lugar, la exposición de los cultivos de células excitables a concentraciones subtóxicas de PLTXs y ácido domoico de forma conjunta induce la aparición de un sinergismo tóxico, que puede ser inhibido mediante el inhibidor de los efectos de las PLTXs o mediante el pretratamiento con un inhibidor de los receptores activados por ácido domoico.

La presente invención se refiere a un método para la detección y cuantificación selectiva de PLTXs en células excitables, que comprende las siguientes etapas:

a) Establecimiento de una relación dosis-respuesta mediante la adición de distintas concentraciones de PLTX a un primer grupo de células excitables.

b) Establecimiento de una relación dosis-respuesta mediante la adición de diluciones seriadas de la muestra problema a un segundo grupo de células excitables. A efectos de la presente invención, una muestra problema se refiere a extractos de alimentos o muestras de aguas en los que se quiere detectar la presencia de PLTX y sus derivados (PLTXs).

c) Establecimiento de una relación dosis-respuesta mediante la adición de diluciones seriadas de la muestra problema a un tercer grupo de células excitables tratadas con una concentración efectiva de un inhibidor de los efectos de las PLTXs.

d) Establecimiento de una relación dosis-respuesta mediante la adición de diluciones seriadas de la muestra problema a un cuarto grupo de células excitables tratadas con una concentración efectiva de un inhibidor de los receptores activados por ácido domoico.

e) Detección de los efectos citotóxicos inducidos en cada grupo de células y cuantificación de los niveles de viabilidad celular mediante el uso de protocolos o métodos efectivos para estos propósitos.

f) Comparación de los niveles de viabilidad entre los diferentes grupos de células para identificar a las PLTXs como los agentes causantes de citotoxicidad y determinar su concentración en la muestra problema.

g) Comparación de los niveles de viabilidad entre los diferentes grupos de células para identificar la presencia conjunta de PLTXs y ácido domoico en la muestra problema.

En una realización preferida, el inhibidor de los efectos de las PLTXs es un inhibidor de la permeabilidad iónica celular.

En otra realización preferida, el inhibidor de los efectos de las PLTXs es una molécula con grupos isotiocianato.

En una realización más preferida el inhibidor de los efectos de las PLTXs es ácido 4,4'-diisotiocianato-estilbeno-2,2'-disulfónico (DIDS).

En otra realización específica, las células excitables son neuronas del sistema nervioso central. En una realización más específica, las células excitables son neuronas granulares de cerebelo de rata en cultivo primario.

En una realización todavía más preferida, el inhibidor de los efectos de las PLTXs es DIDS, las células excitables son neuronas granulares...

1. Método para la detección y cuantificación selectiva de PLTXs en células excitables, que comprende las siguientes etapas:

a) establecimiento de una relación dosis-respuesta mediante la adición de distintas concentraciones de PLTX a un primer grupo de células excitables;

b) establecimiento de una relación dosis-respuesta mediante la adición de diluciones seriadas de la muestra problema a un segundo grupo de células excitables;

c) establecimiento de una relación dosis-respuesta mediante la adición de diluciones seriadas de la muestra problema a un tercer grupo de células excitables tratadas con una concentración efectiva de un inhibidor de los efectos de las PLTXs;

d) establecimiento de una relación dosis-respuesta mediante la adición de diluciones seriadas de la muestra problema a un cuarto grupo de células excitables tratadas con una concentración efectiva de un inhibidor de los receptores activados por ácido domoico;

e) detección de los efectos citotóxicos inducidos en cada grupo de células y cuantificación de los niveles de viabilidad celular mediante el uso de protocolos o métodos efectivos para estos propósitos;

f) comparación de los niveles de viabilidad entre los diferentes grupos de células para identificar a las PLTXs como los agentes causantes de citotoxicidad y determinar su concentración en la muestra problema;

g) comparación de los niveles de viabilidad entre los diferentes grupos de células para identificar la presencia conjunta de PLTXs y ácido domoico en la muestra problema.

2. Método, según reivindicación 1, caracterizado porque el inhibidor de los efectos de las PLTXs es un inhibidor de la permeabilidad iónica celular.

3. Método, según reivindicación 1, caracterizado porque el inhibidor de los efectos de las PLTXs es una molécula con grupos isotiocianato.

4. Método, según reivindicaciones 2 y 3, caracterizado porque el inhibidor de los efectos de las PLTXs es DIDS.

5. Método, según reivindicación 1, caracterizado porque las células excitables son neuronas del sistema nervioso central.

6. Método, según reivindicación 5, caracterizado porque las células excitables son neuronas granulares de cerebelo de rata en cultivo primario.

7. Método, según reivindicación 4 y 6, caracterizado porque la detección de los efectos citotóxicos se realiza mediante la observación de los cultivos celulares con microscopía en contraste de fase.

8. Método, según reivindicación 7, caracterizado porque para concentraciones de PLTXs iguales o superiores a 1 nM la detección de sus efectos citotóxicos se realiza transcurridos 15 min desde las adiciones.

9. Método, según reivindicación 4 y 6, caracterizado porque la detección de los efectos citotóxicos se realiza utilizando colorantes vitales y microscopía de epifluorescencia.

10. Método, según reivindicación 4 y 6, caracterizado porque la cuantificación de los niveles de viabilidad celular se realiza utilizando colorantes vitales y microscopía de epifluorescencia.

11. Método, según reivindicación 10, caracterizado porque para concentraciones de PLTXs iguales o superiores a 1 nM la cuantificación de los efectos citotóxicos se realiza transcurridas 6 horas desde las adiciones, y para concentraciones de PLTX inferiores a 1 nM, transcurridas 24 horas.