MÉTODO PARA LA DETECCIÓN DE ATP EN UNA MUESTRA CON LA AYUDA DE LUMINISCENCIA, Y PROGRAMA INFORMÁTICO PARA LLEVARLO A CABO.

Método para detectar ATP en una muestra mediante luminiscencia,

que comprende las siguientes etapas: 1) adición de un reactivo de luminiscencia a una muestra que no ha sido sometida a tratamiento previo alguno con un agente de extracción, a fin de formar un complejo de ATP, y medición de la luminiscencia en función del tiempo para el complejo de ATP formado de este modo; 2) adición de un agente de extracción somático a la muestra para formar un complejo de ATP, y medición de la luminiscencia en función del tiempo para el complejo de ATP formado de este modo; 3) adición de un agente de extracción microbiano a la muestra para formar un complejo de ATP, y medición de la luminiscencia en función del tiempo para el complejo de ATP formado de este modo; 4) comparación de la luminiscencia en función del tiempo obtenida en la etapa 3) con un valor estándar de luminiscencia en función del tiempo correspondiente a una muestra testigo sin contaminar a fin de determinar si se encuentran presentes células microbianas; 5) identificación de las células microbianas que se encuentran presentes en la muestra mediante comparación de la luminiscencia en función del tiempo obtenida en la etapa 3) con uno o más valores de referencia en función del tiempo correspondientes a las células microbianas;

La presente invención se refiere a un método para la detección de ATP en una muestra con la ayuda de luminiscencia, y un programa informático para llevarlo a cabo.

Se han dictado diversos reglamentos gubernativos relativos a la presencia de contaminantes que afectan a diversos sectores industriales, tales como la industria alimentaria y de las bebidas, así como las industrias clínica, farmacéutica y cosmética. Esto incluye, por ejemplo, la obligación de comprobar (o de ocuparse de que se efectúe su comprobación) la presencia de contaminantes tales como células microbianas (por ejemplo, bacterias, levaduras y hongos) en todos los productos. En ciertas condiciones, la presencia de dichas células microbianas en los productos puede provocar una descomposición acelerada del producto. Estas células microbianas pueden constituir igualmente un importante riesgo para la salud de los consumidores que consumen el producto.

Los métodos convencionales para la detección de la contaminación microbiana implican el crecimiento de las células microbianas hasta que estas pueden ser distinguidas a simple vista. La desventaja de esto es que dichos procesos resultan lentos y puede tardarse varios días en obtener resultados. Estas pérdidas de tiempo hacen que dichos procesos resulten costosos.

Por lo tanto, se conoce desde hace algún tiempo, por ejemplo a través de la patente estadounidense

4.303.752 la utilización de un método de detección de contaminación microbiana en productos, que está basado en la medición del trifosfato de adenosina (ATP) molecular que se encuentra presente en las células microbianas vivas. El ATP puede detectarse en un lapso de tiempo de varios segundos en presencia un reactivo de luminiscencia consistente, por ejemplo, en una combinación de la luciferasa enzimática y su cofactor, la luciferina. La reacción resultante, a la que se suele denominar la “reacción de la luciérnaga”, genera inmediatamente una emisión de luz conocida como luminiscencia del ATP. La cantidad de luz producida es proporcional a la cantidad de ATP contenida en la muestra. La luminiscencia puede medirse con la ayuda de un instrumento de medida, tal como un luminómetro, por ejemplo.

Gracias al documento CH 678065 se conoce la forma de extraer el ATP añadiendo en primer lugar un agente de extracción somático, con lo que se liberará el ATP somático, y posteriormente, un reactivo de luminiscencia. Como resultado de ello se medirá la cantidad combinada de ATP libre y ATP somático. A continuación, dicho ATP combinado podrá eliminarse mediante hidrólisis. Posteriormente, podrá añadirse un agente de extracción microbiano para producir la liberación del ATP microbiano, midiéndose a continuación dicho ATP.

A través de Schram y otros, Journal of Bioluminiscence and Chemiluminiscence, parte 4, páginas. 390-398, 1989, se conoce una mejora del método descrito en CH 678 065, utilizando dicho método ATP-asa de mamíferos.

Gracias al documento US 6951723 se conoce un método para medir el ADP (difosfato de adenosina), un producto de la descomposición del ATP, o para convertir el ADP en ATP y medirlo posteriormente.

No obstante, pueden plantearse graves problemas cuando dichos métodos convencionales de luminiscencia del ATP se utilizan para detectar la presencia de células microbianas vivas en productos.

En primer lugar, el ATP se da no solamente en células microbianas vivas, sino también en otras células no microbianas, a las que se denomina células somáticas. Dichas células somáticas suelen formar parte integrante del producto. Los productos alimenticios y las bebidas, por ejemplo, pueden contener células vegetales, por ejemplo, células de frutas en zumos de frutas, que contienen importantes cantidades de ATP, que normalmente se denomina ATP somático.

Un producto también puede contener el denominado ATP libre, que es un ATP que se da libremente en una muestra y procede de células microbianas y/o somáticas “muertas” y/o rotas y/o dañadas.

Por lo tanto, en una muestra pueden darse tres posibles fuentes de ATP, a saber, ATP libre, ATP microbiano contenido en las células microbianas y ATP somático contenido en las células somáticas, siendo los tres tipos de ATP químicamente idénticos e indistinguibles. Por lo tanto, el ATP libre y el somático habrán de eliminarse antes de que pueda detectar el ATP microbiano, a fin de determinar la presencia de células microbianas.

Un segundo problema que ha de resolverse en relación con la determinación del ATP microbiano es que el ATP microbiano que contienen las células no se encuentra inmediatamente disponible para activar la reacción de luciérnaga para producir luminiscencia. Para ello, el ATP microbiano que contienen las células microbianas debe en primer lugar liberarse o extractarse de la célula microbiana, ya que la reacción de luciérnaga sólo tendrá lugar si el ATP está libremente disponible en la muestra para formar un complejo con el reactivo de luminiscencia (el denominado “complejo de ATP”). Esta liberación suele efectuarse mediante los denominados agentes de extracción, por ejemplo, compuestos cuaternarios de amonio, que actúan como si “perforasen” la membrana celular y/o la pared celular de las células microbianas y/o somáticas para que el ATP pueda fluir de su interior. Las células somáticas son más vulnerables a dichos agestes de extracción que las células microbianas, y por tanto, el ATP somático contenido en las células somáticas se liberará en primer lugar, antes de que el ATP se libere de las células microbianas. La liberación del ATP somático ocultará posteriormente la emisión de luz del correspondiente ATP microbiano, o inducirá a resultados positivos falsos.

Los problemas precedentes han sido resueltos por la técnica anterior utilizando, en primer lugar, un agente de extracción menos potente que es adecuado tan sólo para liberar ATP somático de las células somáticas sin romper las células microbianas. El resultado es una muestra que contiene ATP libre y ATP somático liberado en el que el ATP microbiano está contenido únicamente en células microbianas vivas e intactas. Una vez liberado este ATP somático, el ATP somático liberado y el ATP libre ya presente deben eliminarse antes de que el ATP microbiano pueda liberarse de las células microbianas para proceder a su medición. El ATP somático liberado y el ATP libre se eliminan tratando la muestra con una enzima normalmente denominada ATP-asa, siendo un ejemplo de ello la apirasa. La apirasa puede descomponer selectivamente el ATP libre contenido en una muestra sin descomponer el ATP que contiene las células vivas intactas, como las células microbianas. Normalmente, este es el método estándar utilizado en este campo.

Se entiende que las células intactas son células cuya pared celular y/o membrana celular se encuentra aún intacta y que por consiguiente no han liberado ATP en su entorno. Las células que ya no están “vivas” suelen fragmentarse y, por consiguiente, liberan el ATP que contienen.

La desventaja del método que se ha mencionado es que la apirasa sigue estando activa después de haberse descompuesto el ATP libre y el ATP somático liberado. Esto significa que cuando se añade un agente de extracción microbiano y se libera el ATP microbiano de las células microbianas, este será parcialmente descompuesto por la apirasa presente. Por consiguiente, la apirasa ejerce una influencia negativa sobre los resultados de la medida, porque el valor de la luminiscencia obtenido será inferior a lo esperado. Concretamente, en los casos en los que tan sólo se encuentra presente una pequeña cantidad de células microbianas, esto puede conducir a unos resultados falsamente negativos, ya que todo el ATP microbiano habrá sido descompuesto por la apirasa antes de que sea posible medirlo mediante la luminiscencia. Dicha situación no resulta deseable, debido a que la presencia imperceptible de las células microbianas puede provocar riesgos para la salud del usuario, deterioro y/o pérdida de aroma.

Por lo tanto, es necesario disponer de un método para medir el ATP microbiano de forma rápida y fiable.

Además, es necesario un método en el que no se obtengan resultados falsamente negativos.

Otro de los objetos de la presente invención consiste en permitir una medición rápida y precisa de distintos tipos de células microbianas y distinguirlos entre sí. Es necesario un método que permita distinguir... [Seguir leyendo]

1. Método para detectar ATP en una muestra mediante luminiscencia, que comprende las siguientes etapas:

1) adición de un reactivo de luminiscencia a una muestra que no ha sido sometida a tratamiento previo alguno con un agente de extracción, a fin de formar un complejo de ATP, y medición de la luminiscencia en función del tiempo para el complejo de ATP formado de este modo;

2) adición de un agente de extracción somático a la muestra para formar un complejo de ATP, y medición de la luminiscencia en función del tiempo para el complejo de ATP formado de este modo;

3) adición de un agente de extracción microbiano a la muestra para formar un complejo de ATP, y medición de la luminiscencia en función del tiempo para el complejo de ATP formado de este modo;

4) comparación de la luminiscencia en función del tiempo obtenida en la etapa 3) con un valor estándar de luminiscencia en función del tiempo correspondiente a una muestra testigo sin contaminar a fin de determinar si se encuentran presentes células microbianas;

5) identificación de las células microbianas que se encuentran presentes en la muestra mediante comparación de la luminiscencia en función del tiempo obtenida en la etapa 3) con uno o más valores de referencia en función del tiempo correspondientes a las células microbianas;

2. Método para detectar ATP en una muestra mediante luminiscencia, que comprende las siguientes etapas:

A) adición de un reactivo de luminiscencia a una muestra que no ha sido sometida a tratamiento previo alguno con un agente de extracción, a fin de formar un complejo de ATP, y medición de la luminiscencia en función del tiempo para el complejo de ATP formado de este modo;

B) adición de un agente de extracción microbiano a la muestra para formar un complejo de ATP, y medición de la luminiscencia en función del tiempo para el complejo de ATP formado de este modo;

C) comparación de la luminiscencia en función del tiempo obtenida en la etapa B) con un valor estándar de luminiscencia en función del tiempo correspondiente a una muestra testigo sin contaminar a fin de determinar si se encuentran presentes células microbianas;

D) identificación de las células microbianas que se encuentran presentes en la muestra mediante comparación de la luminiscencia en función del tiempo obtenida en la etapa B) con uno o más valores de referencia en función del tiempo correspondientes a las células microbianas;

3. Método de acuerdo con una o más de las reivindicaciones precedentes, en el que la luminiscencia se mide durante un período de al menos 10 segundos.

4. Método de acuerdo con la reivindicación 3, en el que la luminiscencia se mide durante un período de al menos 20 segundos.

5. Método de acuerdo con la reivindicación 4, en el que la luminiscencia se mide durante un período de al menos 60 segundos.

6. Método de acuerdo con la reivindicación 1, que incluye la etapa adicional de identificación de las células somáticas presentes en la muestra mediante comparación de la luminiscencia en función del tiempo obtenida en la etapa 2) con uno o más valores de referencia en función del tiempo correspondientes a células somáticas.

7. Programa informático para implementar un método de acuerdo con la reivindicación 1, ejecutando dicho programa informático las siguientes etapas:

I) obtención de un valor medido para la luminiscencia del ATP libre mediante un luminómetro que mida la luminiscencia obtenida en la etapa 1), comparándose dicho valor medido de ATP libre con un valor estándar correspondiente a una muestra testigo sin contaminar, y determinación de la presencia de ATP libre si el valor medido es superior al valor estándar;

II) obtención de un valor medido para la luminiscencia del ATP somático mediante un luminómetro que mida la luminiscencia obtenida en la etapa 2), comparándose dicho valor medido de ATP somático con el valor medido del ATP libre obtenido en la etapa I), y determinándose la presencia de ATP somático si el valor medido del ATP somático es más elevado que el valor medido del ATP libre obtenido en la etapa I);

III) obtención de un valor medido para la luminiscencia del ATP microbiano mediante un luminómetro que mida la luminiscencia obtenida en la etapa 3), comparándose dicho valor medido de ATP microbiano con el valor medido del ATP somático obtenido en la etapa II), y determinándose la presencia de ATP microbiano si el valor medido del ATP microbiano es más elevado que el valor medido del ATP somático obtenido en la etapa II);

IV) eventualmente, comparación del valor medido del ATP somático en función del tiempo obtenido en la etapa II) con uno o más valores de referencia en función del tiempo correspondientes a células somáticas, a fin de identificar las células somáticas que se encuentran presentes en la muestra;

V) comparación del valor medido del ATP microbiano en función del tiempo obtenido en la etapa III) con uno o más 5 valores de referencia en función del tiempo correspondientes a células microbianas, a fin de identificar las células microbianas que se encuentran presentes en la muestra;

8. Programa informático para implementar un método de acuerdo con la reivindicación 2, ejecutando dicho programa informático las siguientes etapas:

I) obtención de un valor medido para la luminiscencia del ATP libre mediante un luminómetro que mida la luminiscencia obtenida en la etapa A), comparándose dicho valor medido de ATP libre con un valor estándar correspondiente a una muestra testigo sin contaminar, y determinación de la presencia de ATP libre si el valor medido es superior al valor estándar;

II) obtención de un valor medido para la luminiscencia del ATP microbiano mediante un luminómetro que mida la luminiscencia obtenida en la etapa B), comparándose dicho valor medido de ATP microbiano con el valor medido del ATP libre obtenido en la etapa I), y determinándose la presencia de ATP microbiano si el valor medido del ATP microbiano es más elevado que el valor medido del ATP libre obtenido en la etapa I);

III) comparación del valor medido del ATP microbiano en función del tiempo obtenido en la etapa II) con uno o más valores de referencia en función del tiempo correspondientes a células microbianas, a fin de identificar las células microbianas que se encuentran presentes en la muestra;