Un procedimiento para potenciar los rendimientos y recuperaciones de taxol y taxanos totales a partir de cultivos celulares de Taxus chinensis que comprende:

(a) cultivar células derivadas de tejidos de callos de Taxus chinensis en cultivos celulares en suspensión en un primer medio nutritivo que favorece el crecimiento rápido de las células cultivadas; (b) producir taxol y otros taxanos en un segundo medio nutritivo que está separado y es independiente de dicho primer medio, en el que dicho segundo medio favorece la biosíntesis de taxol y taxano en las células en cultivo y en el que se producen taxol y otros taxanos a niveles superiores a 3 mg/l de taxol; y (c) recuperar dicho taxol y otros taxanos a partir de dichas células y/o dicho medio de producción de dicho cultivo celular

Antecedentes de la invención

A. Campo de la invención

La presente invención está dirigida a procedimientos para mejorar la producción y recuperación de taxol y taxanos mediante cultivos celulares de Taxus chinensis.

B. Técnica relacionada

El problema del suministro de taxol y soluciones posibles

El taxol es un alcaloide diterpenoideo aislado originalmente de la corteza del tejo del pacífico, Taxus brevifolia (Wani y col. 1971).

El interés por el taxol empezó cuando el National Cancer Institute (NCI), en un programa de selección a gran escala, encontró que los extractos de corteza sin elaborar mostraban actividades antitumorales. Desde entonces, los ensayos clínicos han confirmado que el taxol es extremadamente eficaz frente a cánceres de ovario resistentes al tratamiento y frente a cánceres de mama y de otros tipos. El taxol se ha considerado como un gran paso adelante en quimioterapia debido a su mecanismo fundamentalmente diferente de citotoxicidad, es decir, inhibiendo la despolimerización de los microtúbulos (véase Rowinsky y col. 1990).

La variable más desalentadora en la ecuación del taxol hasta el momento es su suministro. Se necesitan de tres a seis tejos del Pacífico de 100 años para tratar a un paciente, debido a que los rendimientos medios de taxol son menores del 0,01% de corteza seca y de agujas (Witherup y col. 1990). Para producir la cantidad de taxol que es necesaria para el tratamiento y realizar las pruebas sería necesaria la destrucción de decenas de miles de tejos. Hasta ahora, el suministro mundial ha venido de la recolección de estas coníferas achaparradas y de lento crecimiento que pueblan los ancianos bosques del noroeste del Pacífico. Desafortunadamente, el tejo está prácticamente extinguido debido a la tala. Los ecologistas han tenido éxito en su oposición a cualquier sacrificio a gran escala del árbol, que crece en los bosques ancianos que dan cobijo al búho moteado del Norte en peligro de extinción y a otras especies salvajes. Ante la reducción del número de tejos del Pacífico, la investigación médica está poniendo sus esperanzas para el taxol futuro en nuevas fuentes alternativas de suministro. Las tres fuentes que han sido consideradas son la síntesis química, la semisíntesis y el cultivo de células vegetales.

El taxol es una molécula química grande y estructuralmente compleja por lo que se elude de lejos una síntesis química total. Por tanto, la síntesis a gran escala a partir de compuestos químicos sencillos disponibles no será probablemente una opción asequible en los próximos años.

Una opción posible para una producción a gran escala es la semisíntesis, es decir el acoplamiento químico de una cadena lateral al precursor de taxol producido mediante cultivo agrícola, la baccatina. Se han hecho progresos significativos en la síntesis de la cadena lateral (Denis y col. 1991). También se han desarrollado procedimientos para unir la cadena lateral a la baccatina (Denis y col. 1990, Patente de EE. UU. Nº 4.924.011; Holton 1991, patente de EE. UU. Nº 5.015.744). Sin embargo, el suministro agrícola de baccatina a partir de las agujas de las plantaciones de Taxus no es nimio en ningún caso, y está siendo actualmente reevaluado a la vista del hecho de que las primeras publicaciones (Denis y col., 1988, 0,1% del peso) eran más optimistas sobre el contenido de baccatina que las más recientes (Witherup y col., 1990, 0,03% del peso seco). En resumen, la capacidad de la síntesis y la semisíntesis química para suministrar taxol para su uso quimioterapéutico a nivel mundial no está asegurada. Existen fuertes razones para la exploración y desarrollo de sistemas de producción alternativos.

La presente invención está relacionada con el desarrollo de un proceso basado en el cultivo de células vegetales para el suministro de taxol y de otros taxanos.

Cultivos tisulares como fuente de productos químicos derivados de plantas

La capacidad de las células vegetales para dividirse, crecer y producir metabolitos secundarios bajo diversos regimenes de cultivos diferentes ha sido ampliamente demostrada por varios grupos. En la actualidad, dos compuestos, shikonina (un colorante rojo antiinflamatorio) y ginsengosida (un tónico utilizado en la medicina oriental) se producen mediante procesos de cultivo tisular en Japón. Se ha informado de muchos otros procesos próximos a su comercialización, como vanilina, berberina y ácido rosmarínico (véase Payne y col. 1991).

Las ventajas de un proceso de cultivo de células vegetales para el taxol son muchas: (i) un proceso de cultivo celular asegura un suministro de producto ilimitado, continuo y uniforme y no está sujeto a plagas, desastres naturales y fluctuaciones estacionales; (ii) los cultivos celulares pueden cultivarse en biorreactores grandes y pueden ser inducidos a producir taxol en exceso manipulando las condiciones ambientales; (iii) los cultivos celulares producen un espectro más simple de compuestos en comparación con la corteza o las agujas, simplificando considerablemente la separación y la purificación, (iv) un proceso de cultivo celular puede adaptarse rápidamente a cambios rápidos a demanda mejor que los procesos agrícolas, (v) además del suministro de taxol, un proceso de cultivo celular también podría producir precursores de taxano como baccatina que podría convertirse semisintéticamente en taxol y en otros derivados activos.

Puesto que los cultivos asépticos y a gran escala de células vegetales son sustancialmente caros, un proceso de cultivo celular se hace comercialmente importante solo cuando estos costes son superados por un rápido crecimiento celular y una alta productividad del metabolito. Cada especie vegetal y metabolito diana es diferente y son necesarias estrategias diferentes para cada sistema en particular. Esta invención se centra en estrategias creativas y especializadas para la obtención de cultivos de células vegetales de rápido crecimiento y alta productividad para la producción de taxol y taxano.

Problemas con los cultivos tisulares de plantas leñosas y coníferas

Una encuesta histórica de la bibliografía sugiere que mientras las plantas herbáceas han sido manipuladas de forma relativamente fácil en cultivo, se han obtenido sólo con dificultad cultivos de plantas leñosas y coníferas.

El crecimiento de cultivos de gimnospermas y coníferas que producen un metabolito secundario ha sido generalmente bajo. Por ejemplo, Berlin y White (1988) encontraron que los cultivos de Thuja occidentalis aumentaban su biomasa en solo aproximadamente el 30% en 18 días. Van Uden y col. (1990) notificaron un aumento de biomasa del 20-50% en 21 días para suspensiones de Callitris drummondii. Westgate y col. (1991) notificaron un tiempo de duplicación de aproximadamente 10 días para suspensiones de la gimnosperma Cephalotaxux harringtonia. Como resumió Bornman (1983), se ha dirigido una tremenda cantidad de esfuerzo hacia el desarrollo de un medio para las suspensiones de abeto falso (Picea abies). Este trabajo colectivo mostró que las suspensiones de gimnospermas pueden, de hecho, crecer rápido, pero no pueden aplicarse como generalización y estas formulaciones de los medios para líneas celulares diferentes deben optimizarse independientemente.

Una encuesta de productividad de metabolitos secundarios entre cultivos de gimnospermas también apunta hacia la dificultad de inducir una biosíntesis rápida en comparación con especies herbáceas. Por ejemplo, los cultivos de Cephalotarus harringtonia producían alcaloides terpenos a un nivel de sólo el 1% al 3% del que se encuentra en la planta parental (Delfel y Rothfus 1977). Incluso después de la provocación eficaz, Heinstein (1985) fue sólo capaz de aproximarse a los niveles producidos en la planta original (aproximadamente el 0,04% del peso seco total de alcaloides). Van Uden y col. (1990) fueron capaces de inducir cultivos en suspensión de la conífera Callitris drummondii para producir podofilotoxina, pero sólo a niveles de una décima parte del producido por las agujas. La capacidad de Thuja occidentalis para producir niveles significativos de monoterpenos (10-20 mg/l) y el diterpenoide dehidroferruginol (2-8 mg/l) ha sido demostrada de forma convincente por Berlin y col. (1988). Sin embargo, estos resultados se obtuvieron con un cultivo de crecimiento lento (30% de aumento de biomasa en 18 días) y baja densidad celular (de 5 a 7 gramos de peso seco por litro).

Cultivo celular para la producción de taxol: esfuerzos previos... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para potenciar los rendimientos y recuperaciones de taxol y taxanos totales a partir de cultivos celulares de Taxus chinensis que comprende:

(a) cultivar células derivadas de tejidos de callos de Taxus chinensis en cultivos celulares en suspensión en un primer medio nutritivo que favorece el crecimiento rápido de las células cultivadas;

(b) producir taxol y otros taxanos en un segundo medio nutritivo que está separado y es independiente de dicho primer medio, en el que dicho segundo medio favorece la biosíntesis de taxol y taxano en las células en cultivo y en el que se producen taxol y otros taxanos a niveles superiores a 3 mg/l de taxol; y

(c) recuperar dicho taxol y otros taxanos a partir de dichas células y/o dicho medio de producción de dicho cultivo celular.

2.. El procedimiento de la reivindicación 1 en el que dicho segundo medio comprende un inductor.

3.. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicho segundo medio comprende nitrato de plata.

4. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicho segundo medio comprende fenilalanina.

5. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4 que además comprende un cambio periódico del medio nutritivo.

6. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5 que además comprende la retirada periódica del taxol y taxano.

7. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6 en el que el procedimiento comprende un proceso de cultivo discontinuo en dos fases, un proceso de cultivo discontinuo alimentado, un proceso continuo o variaciones de los mismos.

8. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7 en el que uno o más medios nutritivos comprenden glutamina.

9. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en el que uno o más medios nutritivos comprenden hormonas vegetales seleccionadas entre el grupo que consiste en por ácido indolbutírico, ácido indolacético, indol-3-acetil fenilalanina, picloram, dicamba, ácido beta-naftaleneacético, ácido beta-naftoxiacético, ácidos clorofenoxiacéticos, N6-banciladenina, kitenina, dimetilalilamino-purina, tidiazorona, zeatina, sulfato de adenina y 2-cloro-4-piridil-N-fenil urea.

10. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que dicho segundo medio comprende un aumento del nivel de sacarosa en comparación con dicho primer medio.

11. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que dicho nivel mayor de 3 mg/l de taxol se produce en 18 días o menos.

12. El procedimiento de la reivindicación 11, en el que dicho nivel mayor de 3 mg/l de taxol se produce en 15 días o menos.