En la presente invención se provee un método de análisis de la resistencia fenotípica de VIH-1 de muestras clínicas a antirretrovirales.

El método hace uso de plásmidos en los que se han creado mutaciones que generan sitios únicos de restricción en posiciones sucesivas del gen pol del virus VIH-1, siendo la expresión de aminoácidos idéntica a la de la secuencia original, de modo que permite la clonación de fragmentos progresivamente mayores del gen pol y/o del gen que codifica para la proteasa del virus VIH procedentes de pacientes en estos plásmidos, y por tanto proporciona un modelo capaz de caracterizar los genes y las subregiones genómicas de VIH-1 implicadas en la resistencia a antirretrovirales

Método de evaluación de resistencia de fenotipos de VIH-1 a antirretrovirales.

En la presente invención se provee un método de análisis de la resistencia fenotípica de VIH-1 de muestras clínicas a antirretrovirales. El método hace uso de plásmidos en los que se han creado mutaciones que generan sitios únicos de restricción en posiciones sucesivas del gen pol del virus VIH-1, siendo la expresión de aminoácidos idéntica a la de la secuencia original, de modo que permite la clonación de fragmentos progresivamente mayores del gen pol y/o del gen que codifica para la proteasa del virus VIH procedentes de pacientes en estos plásmidos, y por tanto proporciona un modelo capaz de caracterizar los genes y las subregiones genómicas de VIH-1 implicadas en la resistencia a antirretrovirales.

Estado de la técnica anterior

El método objeto de la presente invención constituye un sistema alternativo para analizar la resistencia fenotípica de VIH-1 de muestras clínicas a antirretrovirales, cuya eficacia se muestra en el correspondiente ejemplo.

Aunque el virus VIH tipo NL4.3 ha sido usado para la evaluación fenotípica de resistencias de VIH a los antirretrovirales, los sistemas comerciales y experimentales similares al que se presenta en esta invención, no son capaces de facilitar la discriminación en la aportación de diferentes regiones de los fragmentos clonados en la resistencia de diversos fenotipos de VIH a antirretrovirales. Por tanto, se provee de un modelo capaz de caracterizar los genes y las subregiones genómicas de VIH-1 implicadas en la resistencia a antirretrovirales. Con ello se permite la clonación y el estudio de fragmentos progresivamente más largos del mismo gen, con lo que se puede determinar la aportación de las porciones diferentes del espacio de secuencia correspondiente al gen pol, usando cada una de las construcciones tras pseudotiparlas con la secuencia correspondiente del paciente en la valoración de la resistencia a los antirretrovirales.

Las regiones de la proteasa y de la retrotranscriptasa son reguladoras de la actividad del virus VIH-1 en etapas clave del proceso de infección y, por tanto, fundamentales para el éxito de la integración del ADN viral en el ADN del huésped. La proteasa actúa cortando unidades de las proteínas Gag, Pol y de la Gag-Pol. La retrotranscriptasa tiene la función de sintetizar el ADN de doble cadena del provirus usando como patrón la cadena singular del ARN viral; es una ADN-polimerasa que actúa como dependiente del ARN. Una parte de los fármacos empleados para evitar la progresión del ciclo vital del virus VIH son inhibidores de la función de estos genes, así pues, los pseudotipos virales construidos usando secuencias de los genes de los virus aislados en los pacientes en las construcciones descritas en la presente invención, permiten valorar el comportamiento in vivo de estos fármacos en la infección por VIH en experimentos de inhibición de la infección usando concentraciones crecientes de antirretrovirales.

Explicación de la invención

El método de la presente invención hace uso de cuatro plásmidos en los que se han creado mutaciones dirigidas al tercer nucleótido del codón sin cambio en la traducción de una secuencia original, para la valoración de la resistencia fenotípica de VIH-1 a antirretrovirales, es decir, el análisis fenotípico de resistencias VIH que permite valorar el "fitness" genético del virus o el papel de mutaciones compensatorias al usar secuencias más largas de la que habitualmente se usa en este tipo de análisis con NL4.3, que es la integración en el vector del fragmento ApaI-PinA1.

Las cuatro construcciones están basadas en un virus VIH tipo NL4.3 (Adachi et al., 1986. J. Virol. 59:284-291.) NIH AIDS Reagent Reference Program (Cat. Num.: 144.), en las que se han creado mutaciones dirigidas al tercer nucleótido del codón, de forma que, siendo la expresión de aminoácidos idéntica a la de la secuencia original, se generan sitios únicos de restricción en posiciones sucesivas del gen pol del virus VIH-1. Mediante este sistema es posible obtener ácidos nucleicos con cuatro polimorfismos de un solo nucleótido (de las siglas en inglés SNP, Single nucleotide polimorphism) y además, al tener secuencias conocidas, podemos obtener la construcción como ADNs lineales (por corte en lugares únicos comunes como ApaI) o circulares. Alternativamente puede obtenerse por transfección con Calphos^TM (Invitrogen) en células empaquetadoras (por ejemplo, células 293T/17), viriones VIH infecciosos que puedan usarse como origen de ARNs o como herramienta para la infección experimental "in vivo" y la posible valoración de la capacidad inhibitoria de los antirretrovirales. Por tanto, una aplicación clínica o de desarrollo con las construcciones mencionadas es la evaluación de la resistencia de los diferentes fenotipos de VIH-1 a antirretrovirales comerciales o en vías de ensayo.

El método de construcción de los plásmidos consistió en amplificar la región de ADN del VIH-1 correspondiente al gen pol contenida en el plásmido pNL4.3 mediante los cebadores SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6, clonar la región amplificada en un vector de expresión, realizar mutagénesis dirigidas independientes en el vector mediante el empleo de pares de cebadores donde el cebador de selección es SEQ ID NO: 11 y el cebador mutagénico se selecciona de la lista que comprende SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 10 (de modo que se generaron sitios únicos de restricción en posiciones sucesivas del gen pol del virus VIH-1), y reclonar de forma independiente cada uno de los 4 fragmentos obtenidos en el vector original pNL4.3, obteniendo los plásmidos de secuencias SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 4. (Tras obtener las mutaciones en cada uno de los plásmidos de manera independiente se puede seleccionar el fragmento de ADN comprendido entre los sitios de restricción ApaI/PflmI y reclonarlo en el vector original pNL4.3 tras ser digerido previamente con los mismos enzimas de restricción ApaI y PflmI, en este caso). Por tanto, el plásmido de que hace uso el método de la presente invención es un plásmido seleccionado de la lista que comprende SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4.

La secuencia de cada uno de los plásmidos está basada en la del plásmido pNL4.3 que incluye parte de la secuencia del virus VIH-1. Asimismo, también se considera cualquier combinación de los plásmidos de la lista. A continuación describimos las características de las secuencias:

SEQ ID NO: 1. Se sustituyó el nucleótido que ocupaba la posición 4243 del plásmido original pNL4.3 correspondiente al gen pol que cambió el codón ATA (codifica para el aminoácido isoleucina) por ATC (también codifica para el aminoácido isoleucina), generándose de ese modo un nuevo sitio de restricción ClaI.

SEQ ID NO: 2. Se sustituyó el nucleótido que ocupaba la posición 4403 del plásmido original pNL4.3 correspondiente al gen pol que cambió el codón CCA (codifica para el aminoácido prolina) por CCG (también codifica para el aminoácido prolina), generándose de ese modo un nuevo sitio de restricción XmaI.

SEQ ID NO: 3. Se sustituyeron dos nucleótidos que ocupaban las posiciones 4625 y 4626 del plásmido original pNL4.3 correspondiente al gen pol que cambió la secuencia TGGGCG por TGCCCG. Se produjeron dos cambios de aminoácido TGG (codifica para el aminoácido triptófano) por TGC (codifica para el aminoácido cisteína) y GCG (codifica para el aminoácido alanina) por CCG (codifica para el aminoácido prolina), generándose de ese modo un nuevo sitio de restricción XmaI.

SEQ ID NO: 4. Se sustituyó el nucleótido que ocupaba la posición 4688 del plásmido original pNL4.3 correspondiente al gen pol que cambió el codón TCT (codifica para el aminoácido serina) por TCG (también codifica para el aminoácido serina), generándose de ese modo un nuevo sitio de restricción ClaI.

En este aspecto de la invención también se incluyen aquellos plásmidos derivados de los plásmidos SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 4. Por plásmidos derivados se entienden aquellos que conservan las mutaciones que los caracterizan y permiten reconocer las enzimas de restricción que se han descrito anteriormente para cada uno de ellos.

Un aspecto necesario para aplicar el método de la presente invención es una célula empaquetadora... [Seguir leyendo]

1. Método de evaluación de la resistencia de fenotipos de VIH a antirretrovirales que comprende: