MATRICES DE PROTEÍNA DE DOMINIOS VARIABLES DE INMUNOGLOBULINA DE CADENA PESADA DE CAMELIDAE.

Matrices de proteína de dominios variables de inmunoglobulina de cadena pesada de Camelidae Campo de la invención [0001] La presente invención se refiere a matrices de proteína que comprenden una pluralidad de anticuerpos o fragmentos de los mismos, la construcción de tales series y a métodos de uso de las mismas, por ejemplo, en la detección y el análisis paralelo de hasta un gran número de proteínas en una muestra. Antecedentes de la invención [0002] Gran parte de la investigación en biología de célula molecular está se está alejando del método "reduccionista" tradicional de aislamiento y caracterización de estructuras o moléculas individuales de una célula, hacia un más método más holístico, en el que las diversas funciones metabólicas de la célula en conjunto se relacionan con la suma de las moléculas presentes adentro (Lander & Weinberg, Science 287, 1777-1782 (2000 ); Lockhart & Winzeler, Nature 405, 827-836 (2000 ); Hughes et al, Cell 102, 109-126 (2000 )). Se está haciendo cada vez más evidente, por ejemplo, que el progreso en la comprensión y, según corresponda, el diagnóstico, la administración o el tratamiento de una gama completa de condiciones que implican cambios en el metabolismo de las células en un organismo vivo se beneficia de la aplicación de métodos que proporcionan una imagen tan completa como sea posible de los cambios subyacentes tal como el modelo de expresión genética y de contenido de proteína en los diferentes compartimentos de la célula. Esto es cierto en parte porque la mayor parte de los genes o las proteínas puede ser hasta ahora desconocidas, de modo que no habría nada en el conocimiento existente para sugerir la investigación de su relevancia en el contexto de la condición de interés. Además, la condición, en todos los casos más simples, depende del efecto compuesto de cambios subyacentes múltiples, de modo que un punto de vista demasiado simplificado o, en aplicaciones prácticas, un diagnóstico impreciso o un tratamiento ineficaz podría originarse si se focaliza sólo en factores contribuyentes individuales. [0003] En parte, el progreso en esta área es impulsado por los rápido avances en la secuenciación del genoma, lo que ha conducido a la identificación de números inauditos de genes y productos genéticos, cuya existencia y papel en la célula frecuentemente no han sido reconocidos previamente (Goffeau et al, Science 274, 562-567 (1996 ); The C. elegans Sequencing Consortium, Science, 282, 2012-2018 (1998 ); Venter et al., Science 291, 1304-1351 (2001 ); Int Human Genome Sequencing Consortium, Nature 409, 860-921 (2001 )). Un método para identificar cuál de estas proteínas puede ser importante en relación con un aspecto particular de la biología celular es comparar modelos de expresión de los genes que las codifican en diferentes tipos de célula, o bajo condiciones diferentes. Con este fin, ha habido considerable progreso en el desarrollo de métodos para la detección del perfil de expresión global de una célula, en lugar que la focalización en genes individuales, como se hizo típicamente en el pasado. Ha sido clave para esto el desarrollo de matrices de ADN, en las que gran número de secuencias de ADN se inmovilizan en una matriz bien definida en un soporte sólido. Estas matrices hacen posible caracterizar las cantidades de ARNm de gen específico presentes en una célula bajo un conjunto determinado de condiciones fisiológicas, por detección de la hibridación de especies individuales de ARNm para sus fragmentos de ADN correspondientes en la matriz. Los perfiles de expresión resultante proporcionan una manera muy potente de desarrollar nuevas perspectivas de las respuestas celulares a diferentes condiciones. Por ejemplo, este método ha sido usado para detectar cambios en la expresión de múltiples genes durante la tumorigénesis o el envejecimiento (Alizadeh et al., Nature 403, 503-511 (2000); Ly et al., Science 287, 2486-2492 (2000 )). [0004] No obstante, los cambios en niveles ARNm, en general, no se correlacionan directamente con cambios en los niveles de las proteínas que codifican, debido a diferencias en índices de traducción y estabilidad entre diferentes ARNMs, al igual que diferentes índices de producción de las proteínas (Pandey & Mann, Nature 405, 837-846 (2000); Wilkins et al, 'Proteome Research: Frontiers in Functional Genomics' 1-243 (Springer, Berlin, 1997 )). Puesto que son las proteínas las que en realidad facilitan y controlan la gran mayoría de los procesos que tienen lugar en la célula, es evidentemente importante poder complementar los métodos de perfilación de la expresión genética con métodos acompañantes que monitoreen directamente las diferencias en el contenido de proteína bajo diferentes condiciones fisiológicas, con un grado de sensibilidad y velocidad comparable a los alcanzables para el monitoreo de niveles de ARNm de control que usan las matrices de ADN. [0005] Actualmente, el método para usado más frecuentemente para analizar la distribución de las proteínas en una célula es electroforesis bidimensional en geles. Sin embargo, este método no proporciona ni la sensibilidad ni la velocidad de la perfilación de ARNm con las con matrices de ADN. También está seriamente limitado en la resolución, de modo que incluso para una simple célula eucariótica tal como Saccharomyces cerevisiae, que tiene sólo 6220 genes, los geles bidimensionales son incompletos, difíciles de reproducir y de interpretar. Por otra parte, casi siempre las proteínas abundantes enmascara n la presencia de proteínas menos abundantes, que son las proteínas implicadas en procesos de regulación importantes en la célula (Anderson & Andeson, Electrophoresis 17, 443-453 (1996); Lottspeich, Ang. Chem. Int. Ed. 38, 2476-2492 (1999)). [0006] Otro modo de abordar el problema de analizar el contenido de proteína de tales sistemas complejos es generar una biblioteca de anticuerpos con especificidad de enlace para proteínas diferentes y determinar qué proteínas están presentes en realidad en un sistema de prueba por detección de unión al anticuerpo cognado usando un inmunoensayo adecuado. Recientemente, este método también se ha extendido para comprender el potencial de la tecnología de matrices, con anticuerpos que se inmovilizan en una superficie y la unión de antígenos 2   adecuadamente marcados a éstos, que son detectados usando un sistema de formación de imágenes ópticas. La limitación de estos métodos ha sido, no obstante, que ha sido muy costoso y difícil generar una biblioteca suficientemente completa de anticuerpos con afinidad de enlace suficiente para ser útil. Por otra parte, la estabilidad limitada de los anticuerpos y su naturaleza adherente intrínseca hace prácticamente imposible desarrollar matrices fiables basadas en anticuerpos tradicionales (Borrebaeck, Immunology Today 21 8 (2000)). [0007] El abordaje tradicional del desarrollo de anticuerpos implica la inmunización de un animal con un único inmunógeno purificado y el aislamiento de las inmunoglobulinas o la clonación y la selección de secuencias de codificación de anticuerpo de este animal. Este es un proceso lento, no obstante, y depende de la identificación y la purificación en cantidad considerable de todas las proteínas individuales de interés de antemano. Por lo tanto, no se puede esperar razonable poder proporcionar una diversidad suficiente de anticuerpos. Un método alternativo cuyo uso se ha implementado recientemente implica la selección de anticuerpos capaces de unirse a por lo menos una de las proteínas de interés de una biblioteca amplia y variada de anticuerpos derivados sintéticamente o de una fuente no inmunizada. [0008] Otro problema significativo en el intento de correlacionar diferencias en el comportamiento y las propiedades de las células con diferencias en el contenido de proteína es que la sobrecogedora mayoría de proteínas, de hecho, no están presentes en niveles significativamente diferentes en ninguna de las dos condiciones de célula diferentes, de modo que la mayor parte de la información en, por ejemplo, un análisis de matriz de anticuerpos resulta ser irrelevante para la condición particular de interés. El riesgo es que en aquellos casos donde hay una diferencia significativa, particularmente si las proteínas implicadas no están entre las más abundantes en la célula cualquiera de los conjuntos de condiciones, pueden perderse contra los antecedentes de las señales de todas las otras proteínas irrelevantes. Un problema relacionado es que sólo 10% de las proteínas representan 90% de la masa en proteínas en células (proteínas abundantes). Si el etiquetando se realiza en extractos totales, las proteínas menos abundantes serán marcadas sólo con una eficiencia de aproximadamente 10%, lo cual hace que su detección sea casi imposible, en particular... [Seguir leyendo]

1. Una matriz de proteína que comprende una pluralidad de dominios variables de cadena pesada derivados de una inmunoglobulina que está naturalmente desprovista de cadenas ligeras (dominio VHH) obtenible de Camelidae, y donde los dominios variables de cadena pesada se derivatizan con un grupo químico a través del cual los dominios variables de cadena pesada se acoplan a la matriz, o donde los dominios variables de cadena pesada se acoplan a la matriz a través de una extensión peptídica, con la condición de que los dominios variables de cadena pesada no sean acoplados de manera covalente a la matriz por un segmento de polipéptido que es capaz de adoptar una estructura plegada separada a partir de la estructura plegada del resto de los dominios variables de cadena pesada, conteniendo el segmento de polipéptido al menos un residuo reticulable para unión covalente a una superficie sólida y donde el segmento de polipéptido tiene la estructura genérica AZB donde A y B son regiones de secuencia peptídica que pueden unirse para formar una estructura, y Z es una región de secuencia peptídica capaz de formar un lazo. 2. Matriz de proteínas según la reivindicación 1 que comprende dominios variables de cadena pesada a partir de una biblioteca que comprende secuencias de ADN clonadas que codifican dominios variables de cadena pesada, caracterizada por el hecho de que los clones se derivan de un animal no inmunizado del género Camelidae. 3. Matriz de proteínas según la reivindicación 1 o 2, que comprende además: (a) una superficie sólida; (b) una pluralidad de dominios variable de cadena pesada inmovilizados en posiciones diferentes en la superficie sólida, caracterizada por el hecho de que cada dominio variable de cadena pesada es capaz de unirse a un antígeno de proteína específica. 4. Matriz de proteínas según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada por el hecho de que los dominios variables de cadena pesada han sido derivados por selección de una biblioteca que usa el método de expresión de fago o de eucariota inferior. 5. Matriz de proteínas según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada por el hecho de que los dominios variables de cadena pesada han sido inmovilizados por unión química por medio de extensiones de péptido N- o C- terminales de los dominios variables de cadena pesada. 6. Matriz de proteínas según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada por el hecho de que los dominios variables de cadena pesada se biotinilan y se acoplan a la matriz con una superficie derivatizada con estreptavidina. 27   28   29     31