Una composición que comprende una lisina mutante hiperactiva de PlyGBS con una actividad destructora mayor frente a células de estreptococos del grupo B (GBS) en comparación con la proteína PlyGBS,

teniendo la lisina mutante de PlyGBS una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por: PlyGBS 90-1 (SEQ ID NO: 5), PlyGBS 80 (SEQ ID NO: 3), PlyGBS 90-8 (SEQ ID NO: 4) y PlyGBS 94 (SEQ ID NO: 8)

Lisinas mutantes de Ply-GBS.

Esta invención se refiere a la identificación y el uso de enzimas líticas asociadas a fagos para detectar o destruir rápida y específicamente ciertas bacterias, tales como las bacterias estreptocócicas del grupo B (Group B streptococci, GBS).

Antecedentes

Los estreptococos del grupo B (GBS), o Streptococcus agalactiae, son una importante causa de infección bacteriana neonatal en los Estados Unidos (Baker, C. J., y M. S. Edwards, "Group B streptococcal infections", págs. 1091-1156 en J. Remmington y J. O. Klein (ed.), Infectious diseases of the fetus y newborn infants, 5ª ed. The W. B. Saunders Co. Philadelphia, PA (2001)). Los GBS generalmente colonizan los tractos genital y gastrointestinal inferior en humanos, y pueden ser trasmitidos verticalmente de la madre al hijo durante un parto vaginal normal. Las manifestaciones habituales de la enfermedad por GBS en neonatos incluyen septicemia, meningitis, neumonía e infecciones articulares. Aproximadamente el 21% de las mujeres embarazadas están colonizadas vaginalmente con GBS y un significativamente alto porcentaje de bebés desarrolla los síntomas asociados a la infección por GBS. Por ejemplo, aparece septicemia en 16 de cada 1.000 recién nacidos vivos de mujeres con colonización por GBS, mientras que sólo en 0,4 de cada 1.000 recién nacidos vivos de mujeres sin colonización por GBS (Regan, J. A., M. A. Klebanoff, R. P. Nugent & otros 7 autores. 1996. Colonization with group B streptococci in pregnancy y adverse outcome. Am. J. Obstet. Gynecol. 174: 1354-1360).

La profilaxis antibiótica durante el parto (intrapartum antibiotic prophylaxis, IAP) es la prevención primaria sugerida por los Centros de Control y Prevención de Enfermedades (Centers for Disease Control y Prevention, CDC) porque puede reducir eficazmente la colonización neonatal por GBS y el comienzo temprano de la infección (Centros de Control y Prevención de Enfermedades, "Prevention of perinatal group B streptococcal disease: a public health perspective", Morbid. Mortal. Weekly Rep. 45: 1-24 (1996); y Centros de Control y Prevención de Enfermedades, "Prevention of perinatal group B streptococcal disease: revised guidelines from CDC", Morbid. Mortal. Weekly Rep. 51: 1-22 (2002)). La IAP se administra habitualmente a mujeres embarazadas colonizadas por GBS 4 h antes del parto para prevenir la transmisión vertical. Sin embargo, hay muchos lugares en el mundo en los que el cribado de cultivos de GBS no es rutinario para mujeres embarazadas, y la administración universal de antibióticos puede suponer una potencial amenaza para los neonatos. La resistencia a los antibióticos es otra preocupación importante porque ya se ha encontrado que algunas cepas clínicas de GBS son resistentes a eritromicina y clindamicina (Fernández, M., M. Hickman y C. J. Baker, "Antimicrobial susceptibilities of group B streptococci isolated between 1992 y 1996 from patients with bacteremia or meningitis", Antimicrob. Agents Chemother. 42: 1517-1519 (1998); Centros de Control y Prevención de Enfermedades, "Prevention of perinatal group B streptococcal disease: revised guidelines from CDC", Morbid. Mortal. Weekly Rep. 51: 1-22 (2002)). Por lo tanto, hay una necesidad de una alternativa directa y eficaz a la IAP.

Una metodología prometedora en la detección y el tratamiento de bacterias patógenas es el uso de enzimas líticas de bacteriófagos como agentes bacteriolíticos. Las enzimas líticas de bacteriófagos responsables de la lisis del hospedador bacteriano también se conocen como lisinas. Muchas lisinas pueden romper rápidamente la pared celular bacteriana con objeto de liberar el fago de descendencia (Young, R. 1992. Bacteriophage lysis: mechanism y regulation. Microbiol. Rev. 56: 430-481). Estructuralmente, las lisinas se encuentran habitualmente como proteínas modulares con un dominio amino terminal que les confiere la actividad enzimática para un enlace de peptidoglucano, y un dominio carboxi terminal que les confiere un especificidad de unión a un epítopo de carbohidrato en la pared celular bacteriana (Loessner, M., K. Kramer, F. Ebel y S. Scherer, "C-terminal domains of Listeria monocytogenes bacteriophage murein hydrolases determine specific recognition y high-affinity binding to bacterial cell wall carbohydrates", (Mol. Microbiol. 44: 335-349 (2002); López, R., E. García, P. García y J. L. García, "The pneumococcal cell wall degrading enzymes: a modular design to create new lysins?", MicroB. Drug Resist. 3: 199-211 (1997); López, R., M. P. González, E. García, J. L. García y P. García, "Biological roles of two new murein hydrolases of Streptococcus pneumonia representing examples of module shuffling", Res. Microbiol. 151: 437-443 (2002); Sheehan, M. M., J. L. García, R. López y P. García, "The lytic enzyme of the pnemococcal phage Dp-1: a chimeric enzyme of intergeneric origin", Mol. Microbiol. 25: 717-725 (1997)). Se cree que las lisinas proporcionan al menos una de las siguientes actividades enzimáticas frente a un sustrato de peptidoglucano: muramidasas, glucosaminidasas, N-acetilmuramil-L-alanina amidasa y endopeptidasas (Ioung, R., "Bacteriophage lysis: mechanism y regulation", Microbiol. Rev. 56: 430-481 (1992)). Puede aplicarse una lisina purificada a partir de un bacteriófago exógenamente para que afecte a la lisis bacteriana (Loeffler, J. M., D. Nelson y V. A. Fischetti, "Rapid killing of Streptococcus pneumoniae with a bacteriophage cell wall hydrolase", Science. 294: 2170-2172 (2001); Loessner, M., G. Wendlinger y S. Scherer, "Heterogeneous endolysins in Listeria monocytogenes bacteriophages: a new class of enzymes y evidence for conserved holin genes within the siphoviral lysis cassettes", Mol. Microbiol. 16: 1231-1241 (1995); Loessner, M., S. K. Maier, H. Daubek-Puza, G. Wendlinger y S. Scherer, "Three Bacillus cereus bacteriophage endolysins are unrelated but reveal high homology to cell wall hydrolases from different bacilli", J. Bacteriol. 179: 2845-2851 (1997); Nelson, D., L. Loomis y V. A. Fischetti, "Prevention y elimination of upper respiratory colonization of mice by group A streptococci by using a bacteriophage lytic enzyme", Prot. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 98: 4107-4112 (2001)).

Las lisinas normalmente son muy específicas de la especie bacteriana a partir de la cual se aisló la lisina derivada del fago (Fischetti, V. A. 2003. Novel method to control pathogenic bacteria on human mucous membranes. Ann. N. Y. Acad. Sci. 987: 207-214; Fischetti, V. A. 2001. Phage antibacterials make a comeback. Nature Biotechnol. 19: 734-735). Aunque la gama de bacterias que son el objetivo de las lisinas es menos restrictiva que el correspondiente bacteriófago, las lisinas todavía mantienen un grado de especificidad, teniendo unos efectos mínimos sobre otras bacterias, incluyendo organismos comensales. Aunque las gamas de hospedadores bacteriófagos son ampliamente restrictivas, reconociendo sólo un antígeno específico en su hospedador bacteriano, las lisinas de fagos son menos restrictivas, reconociendo una molécula de carbohidrato específica común a la especie particular de bacterias hospedadoras.

Se cree que es menos probable que aparezca resistencia bacteriana a las lisinas de fagos en comparación con la adsorción bacteriófaga por al menos dos razones: en primer lugar, la lisis bacteriana tras la exposición a la lisina es prácticamente inmediata, y no permite a las bacterias muchas posibilidades de mutación, y en segundo lugar, las lisinas se unen a moléculas altamente conservadas en la pared celular bacteriana que están bajo una presión selectiva para no mutar. Por el contrario, la resistencia bacteriana a muchos antibióticos a menudo es fácilmente identificada. Adicionalmente, el problema de la conversión lisogénica se reduce o elimina con las lisinas de fagos, y las pruebas y el tratamiento en animales pueden realizarse eficazmente usando lisinas.

Hay una continua necesidad de terapias y agentes eficaces en el diagnóstico y control de la contaminación, la colonización y la infección bacterianas. Además, los compuestos con efectos bactericidas pueden ser útiles en la descontaminación de bacterias en superficies y objetos inanimados. Las enzimas líticas bacteriófagas proporcionadas son útiles proporcionando agentes útiles en la detección o destrucción de bacterias estreptocócicas del grupo B (GBS).

Resumen

La presente invención se refiere a lisinas bacterianas que comprenden una variante del péptido PlyGBS con actividad de destrucción bacteriana. Por ejemplo, la variante del... [Seguir leyendo]

1. Una composición que comprende una lisina mutante hiperactiva de PlyGBS con una actividad destructora mayor frente a células de estreptococos del grupo B (GBS) en comparación con la proteína PlyGBS, teniendo la lisina mutante de PlyGBS una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por: PlyGBS 90-1 (SEQ ID NO: 5), PlyGBS 80 (SEQ ID NO: 3), PlyGBS 90-8 (SEQ ID NO: 4) y PlyGBS 94 (SEQ ID NO: 8).

2. Una lisina mutante de PlyGBS con una actividad destructora mayor frente a células de estreptococos del grupo B (GBS) en comparación con la proteína PlyGBS en la que la lisina mutante de PlyGBS se selecciona del grupo constituido por: PlyGBS 80 (SEQ ID NO: 3), PlyGBS 90-8 (SEQ ID NO: 4), PlyGBS 90-1 (SEQ ID NO: 5) y PlyGBS 94 (SEQ ID NO: 8).

3. La lisina mutante de PlyGBS según la reivindicación 2, en la que la lisina mutante de PlyGBS se selecciona del grupo constituido por: PlyGBS 90-8 (SEQ ID NO: 4), PlyGBS 90-1 (SEQ ID NO: 5) y PlyGBS 94 (SEQ ID NO: 8).

4. La lisina mutante de PlyGBS según una cualquiera de las reivindicaciones 2 ó 3, en la que la lisina mutante de PlyGBS es PlyGBS 90-1 (SEQ ID NO: 5).

5. Una composición que comprende la lisina mutante de PlyGBS según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4 y glicerol.

6. Uso de una lisina mutante de PlyGBS con una actividad destructora mayor frente a bacterias de estreptococos del grupo B (GBS) en comparación con la proteína PlyGBS en la elaboración de un medicamento para el tratamiento de una infección, en el que la lisina mutante es un polipéptido seleccionado del grupo constituido por: PlyGBS 90-1 (SEQ ID NO: 5), PlyGBS 80 (SEQ ID NO: 3), PlyGBS 90-8 (SEQ ID NO: 4) y PlyGBS 94 (SEQ ID NO: 8).

7. El uso según la reivindicación 6, en el que la lisina mutante de PlyGBS se selecciona del grupo constituido por: PlyGBS 90-8 (SEQ ID NO: 4), PlyGBS 90-1 (SEQ ID NO: 5) y PlyGBS 94 (SEQ ID NO: 8).

8. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones 6 ó 7, en el que el medicamento se prepara para su administración a un pH de aproximadamente 5,0.

9. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, en el que el medicamento comprende NaCl a una concentración de aproximadamente 50-100 mM.

10. Una lisina mutante de PlyGBS con una actividad destructora mayor frente a células de estreptococos del grupo B (GBS) en comparación con la proteína PlyGBS en la que la lisina mutante de PlyGBS se selecciona del grupo constituido por: PlyGBS 80 (SEQ ID NO: 3), PlyGBS 90-8 (SEQ ID NO: 4), PlyGBS 90-1 (SEQ ID NO: 5) y PlyGBS 94 (SEQ ID NO: 8) para su uso como un medicamento.

11. Una lisina mutante de PlyGBS con una actividad destructora mayor frente a células de estreptococos del grupo B (GBS) en comparación con la proteína PlyGBS en la que la lisina mutante de PlyGBS se selecciona del grupo constituido por: PlyGBS 80 (SEQ ID NO: 3), PlyGBS 90-8 (SEQ ID NO: 4), PlyGBS 90-1 (SEQ ID NO: 5) y PlyGBS 94 (SEQ ID NO: 8) para su uso en el tratamiento de una infección.