Un procedimiento de producción de proteína recombinante que usa los mohos koji recombinantes que se obtienen introduciendo el producto obtenido por ligadura de un gen que codifica una proteína de interés aguas debajo de un promotor de un gen que codifica cualquier enzima seleccionado del grupo constituido por glucoamilasa,

α-amilasa estable a ácidos, αamilasa y proteasa ácida, en mohos koji blancos o mohos koji negros como huésped, o usando los mohos koji recombinantes que se obtienen introduciendo el producto obtenido por ligadura de un gen que codifica una proteína de interés aguas abajo de un promotor de un gen que codifica cualquier enzima seleccionado del grupo constituido por glucoamilasa, α-amilasa, Βglucanasa y proteasa ácida, en mohos koji amarillos como huésped, que comprende: cultivo de mohos koji recombinantes en un medio líquido que contiene el material de partida de cultivo compuesto por cebada y/o trigo, cuya superficie se encuentra completa o parcialmente cubierta con cascarilla, procurando que queden excluidos productos triturados; y recogida de la proteína recombinante del producto de cultivo

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Campo técnico

La presente invención se refiere a un procedimiento de producción de proteína recombinante, y de forma más particular, a un procedimiento de producción de proteína recombinante que usa mohos koji como huésped. Técnica anterior

El koji se ha usado como fuentes de enzima en la producción de alimentos y bebidas fermentadas desde hace mucho tiempo. Cuando se usa koji para la producción de alimentos y bebidas fermentadas, se ha usado convencionalmente el koji sólido que se obtiene mediante cultivo de mohos koji sobre la superficie de cereales y similares. El koji sólido se obtiene mediante un procedimiento de producción tradicional. Sin embargo, el procedimiento es un modo de cultivo especial, es decir, cultivo en sólido, que no es adecuado para producción a gran escala.

Por otro lado, el koji líquido que es un producto de cultivo de mohos koji obtenidos mediante cultivo en líquido de mohos koji, puede controlar el cultivo fácilmente, y constituye un modo de cultivo adecuado para producción eficiente.

No obstante es bien conocido que el moho koji líquido no proporciona suficiente actividad de enzima requerida para la producción de alimentos y bebidas fermentadas, de modo que hay pocos ejemplos en los que se use el koji líquido para la producción real (véanse documentos no patentes 1 a 4).

Los mohos koji proliferan fácilmente, por tanto se pueden preparar medios a bajo coste, sin que se requieran equipos de cultivo especiales, de modo que el coste para el cultivo es bajo. Los mohos koji se han usado para la producción de alimentos y bebidas fermentadas desde hace mucho tiempo ya que son reconocidos como un huésped seguro. Por tanto, se ha intentado convencionalmente incorporar un gen derivado de mohos koji o de los otros organismos usando los mohos koji como huésped para expresar fuertemente los genes con lo que se producen productos derivados de los genes, es decir, proteínas recombinantes (véase el documento no patente 5).

Se ha descrito también un ejemplo exitoso de producción de proteína recombinante con altos rendimientos mediante cultivo en sólido con salvado de trigo (véase el documento no patente 6). Sin embargo la producción se llevó a cabo en un modo de cultivo especial, es decir, cultivo en sólido, de modo que no es adecuado para la producción a gran escala.

Por otro lado se ha pensado que el cultivo en líquido proporciona inherentemente pocas proteínas fuera de las células como se describe anteriormente, y por tanto no es adecuado para la producción en masa de proteína recombinante.

Documento no patente 1: Hata Y. y col.: J. Ferment. Bioeng., 84, 532-537 (1997).

Documento no patente 2: Hata Y. y col.: Gene, 207, 127 – 134 (1998)

Documento no patente 3: Ishida H. y col.: J. Ferment. Bioeng., 86, 301-307 (1988).

Documento no patente 4: Ishida H. y col.: Curr. Genet., 37, 373-379 (2000).

Documento no patente 5: R. J. Gouka, y col., Appl. Microbiol. Biotechnol., 47, 1-11 (1997)

Documento no patente 6: K. Tsuchiya, y col., Biosci. Biotech. Biochem., 58, 895-899 (1994)

Divulgación de la invención

Problemas a ser resueltos con la invención

Es un objeto de la presente invención proporcionar un procedimiento de producción en masa de proteína recombinante con el procedimiento de cultivo en líquido usando mohos koji como huésped, que se ha creído convencionalmente que no es adecuado para la producción de proteína recombinante debido a las razones anteriormente citadas.

Medios para resolver los problemas

Los inventores de la presente invención ya han propuesto procedimientos de producción de koji líquido que presentan suficiente actividades de enzima (véanse las solicitudes de patente japonesa números 2004-350661, 2004-352320, 2004-352324, 2004-378453 y 2005290648, y JP-A-2003-265165). Estos procedimientos usan como un medio el material de partida cuya superficie está completa o parcialmente cubierta al menos con cascarillas para evitar la liberación de nutrientes desde el material de partida al sistema de cultivo, y de este modo se obtienen las actividades de enzimas requeridas, en particular, enzimas amilolíticas, enzimas celulolíticas y enzimas proteolíticas. De acuerdo con los procedimientos se obtiene actividades de enzima mayores que las obtenidas con cultivo en líquido usando como material de partida cebada perlada o arroz perlado que es un material de partida del soju. Ejemplos de los mohos koji comprenden mohos koji blancos, mohos koji negros, mohos koji amarillos y mohos koji rojos.

Se supone que los procedimientos anteriormente citados de producción de koji líquido aumenta los niveles de transcripción de genes que codifican las enzimas afectadas por la represión de catabolito debido a concentraciones de nutrientes tales como sacáridos y aminoácidos, y de este modo se generan los productos (es decir, enzimas de interés) derivados de los genes que son producidos y secretados fuera de las células de mohos koji.

Un gen que codifica una proteína de interés se liga aguas abajo del promotor de un gen que codifica el enzima afectado por la represión del catabolito debido a las concentraciones de nutrientes tales como sacáridos y aminoácidos, creando de este modo mohos koji recombinantes que presentan incorporado en su interior el producto ligado, cultivando los mohos koji recombinantes de acuerdo con los procedimientos anteriormente citados de producción de koji líquido, y por tanto se produce la proteína recombinante de interés en altos rendimientos.

Factor importante adicional en la producción de proteína recombinante es que la proteína recombinante traducida es transportada apropiadamente fuera de las células del huésped. Incluso si los niveles de transcripción sencillamente aumentan, se pueden acumular frecuentemente proteínas recombinantes traducidas en una célula, o se descomponen con enzimas inherentemente secretadas por el huésped. Además no se produce una proteína que se pliega de forma apropiada y que tiene actividad equivalente a la de una proteína natural a menos que la proteína recombinante se vea sometida a modificación requerida durante el transporte de la misma fuera de las células del huésped.

Al mismo tiempo es muy posible producir y secretar mayor número de proteínas recombinantes con la técnica de producción de koji líquido que se describió anteriormente con uso de mohos koji como huésped. Se puede obtener también una proteína recombinante pretendida con altos rendimientos con lo que se puede producir fuera de los mohos koji huésped, como una proteína de fusión de la proteína recombinante con el enzima que se produce inherentemente y secreta por lo mohos koji huésped, y la proteína de fusión contenida en un sobrenadante de cultivo es escindida en el punto de ligadura de la misma con proteasa dirigida al sitio.

En base a los hallazgos anteriormente citados la presente invención se completa como sigue.

Por tanto, la presente invención de acuerdo con la reivindicación 1, proporciona un procedimiento de producción de proteína recombinante usando los mohos koji recombinantes que se obtienen mediante transformación de mohos koji como huésped comprendiendo: cultivo de los mohos koji recombinantes en un medio líquido que contiene como material de partida de cultivo al menos uno seleccionado del grupo constituido por cereal cuya superficie se encuentra completa o parcialmente cubierta al menos con cascarillas, la semilla y/o el tubérculo cuya superficie se cubre con envolturas y el amaranto y/o la quinoa sin pretratamiento tal como molienda o trituración; y se recoge la proteína recombinante del producto de cultivo.

La presente invención, de acuerdo con la reivindicación 2, proporciona el procedimiento de producción de proteína recombinante de acuerdo con la reivindicación 1, en la que los mohos koji recombinantes se obtienen de modo que un gen que codifica una proteína de interés es ligada aguas abajo del promotor de un gen que codifica el enzima afectado por la represión del catabolito debido a concentraciones de nutrientes tales como sacáridos y aminoácidos, con lo que se obtiene un producto ligado, y se introduce el producto ligado en

mohos koji como huésped.

La presente invención, de acuerdo con la reivindicación 3, proporciona el procedimiento de producción de proteína...

1. Un procedimiento de producción de proteína recombinante que usa los mohos koji recombinantes que se obtienen introduciendo el producto obtenido por ligadura de un gen que codifica una proteína de interés aguas debajo de un promotor de un gen que codifica cualquier enzima seleccionado del grupo constituido por glucoamilasa, α-amilasa estable a ácidos, αamilasa y proteasa ácida, en mohos koji blancos o mohos koji negros como huésped, o usando los mohos koji recombinantes que se obtienen introduciendo el producto obtenido por ligadura de un gen que codifica una proteína de interés aguas abajo de un promotor de un gen que codifica cualquier enzima seleccionado del grupo constituido por glucoamilasa, α-amilasa, βglucanasa y proteasa ácida, en mohos koji amarillos como huésped, que comprende:

cultivo de mohos koji recombinantes en un medio líquido que contiene el material de partida de cultivo compuesto por cebada y/o trigo, cuya superficie se encuentra completa o parcialmente cubierta con cascarilla, procurando que queden excluidos productos triturados; y

recogida de la proteína recombinante del producto de cultivo.

2. El procedimiento de producción de la proteína recombinante de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la cebada y/o trigo cuya superficie se encuentra completa o parcialmente cubierta con cascarillas es cebada perlada que presenta una relación de perlado no inferior a 93%.

3. El procedimiento de producción de proteína recombinante de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en el que el material de partida de cultivo se compone de cebada cuya superficie se encuentra completa o parcialmente cubierta con cascarillas, procurando que queden excluidos productos triturados.