Un polipéptido purificado que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en:

a) la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 2, 4 o 35; y b) una secuencia que tiene al menos un 65% de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 2

CAMPO TÉCNICO

La invención se refiere a procedimientos y materiales para diagnosticar afecciones cardiacas tales como insuficiencia cardiaca y, más particularmente, para diagnosticar afecciones cardiacas mediante la detección de isoformas del péptido natriurético cerebral (BNP). La invención también se refiere a procedimientos y materiales para 5 tratar afecciones cardiacas (por ejemplo, insuficiencia cardiaca) y afecciones renales (por ejemplo, insuficiencia renal).

ANTECEDENTES

Los miembros de la familia del péptido natriurético son hormonas que regulan la homeostasis de fluidos corporales. El péptido natriurético atrial (ANP) se secreta por miocitos auriculares en respuesta a un aumento del 10 volumen intravascular. Una vez que el ANP está en la circulación, sus efectos se localizan principalmente en el riñón, el tejido vascular y la glándula suprarrenal, en la que sus acciones conducen a la excitación del sodio y agua por los riñones y a una reducción del volumen intravascular y la presión sanguínea. El BNP también procede de células miocárdicas y, como el ANP, circula en el plasma humano. El BNP es natriurético, inhibidor de renina, vasodilatador y lusitrópico. La forma circulante y de almacenamiento principal del BNP es un péptido de 32 15 aminoácidos con una estructura de anillo. Las acciones fisiológicas del BNP están mediadas por un receptor asociado a guanilato ciclasa, el receptor de péptido natriurético A (NPR-A). La eliminación del BNP se promueve por un receptor NPR-C que lo elimina de la circulación. El BNP también se degrada por escisión enzimática mediante una endopeptidasa neutra. El péptido natriurético de tipo C (CNP) procede de células endoteliales y funciona como un péptido vasodilatador e inhibidor del crecimiento. El péptido natriurético de Dendroaspis (DNP) es similar en 20 estructura al ANP, BNP y CNP, y se aísla a partir del veneno de Dendroaspis angusticeps o mamba verde.

El ANP y BNP están aumentados en el plasma y corazón durante la insuficiencia cardiaca congestiva en seres humanos, y ejercen acciones protectoras cardiorrenales además de servir como marcadores séricos de disfunción ventricular. Las pruebas epidemiológicas indican que al menos un 3% de la población adulta de más de 45 años puede tener disfunción sistólica ventricular y el 52% puede ser asintomático. El documento WO 95/24419 25 describe procedimientos y materiales para identificar inhibidores de transacciones moleculares mediadas por dominios SH3. El número de registro de EBI EMBL:BQ130005 proporciona una secuencia de ARNm 3' del clon de ADNc de Homo sapiens de insulinoma Humano IMAGE:5777983. El número de registro de EBI EMBL:BQ130258 proporciona un clon de ADNc de Homo sapiens de insulinoma Humano IMAGE:5777983 5' similar a la secuencia de ARNc del PRECURSOR DEL PÉPTIDO NATREURÉTICO CEREBRAL SW:ANFB_HUMAN P16860. El documento 30 WO0071576 se refiere a vectores de adenovirus que codifican péptido natriurético. El número de registro de EBI EMBL:M25296 proporciona un ARNm de precursor de péptido natriurético humano, con cds completas. OGAWA Y Y COL. describen la clonación molecular del ADN complementario y un gen que codifica el péptido natriurético cerebral de ratón y la generación de ratones transgénicos que sobreexpresan el gen del péptido natriurético cerebral (Mayo de 1994 (1994-05), THE JOURNAL OF CLINICAL INVESTIGATION MAYO de 1994, VOL. 93, NR. 5, 35 PÁGINA(S) 1911 - 1921). VALLI N Y COL. proporcionan una revisión de 10 años del uso clínico del péptido natriurético cerebral en cardiología (Noviembre de 1999 (1999-11), THE JOURNAL OF LABORATORY AND CLINICAL MEDICINE NOV 1999, VOL. 134, NR. 5, PÁGINA(S) 437 - 444). El documento WO 02/24895 se refiere a FACTORES DE TRANSCRIPCIÓN Y PROTEÍNAS CON DEDOS DE CINC.

SUMARIO 40

La invención se define por las reivindicaciones adjuntas.

La invención se basa en la identificación de nuevas formas de BNP generadas por corte y empalme alternativo. Como alternativa, las isoformas de BNP humanas sometidas a corte y empalme contienen la estructura de anillo disulfuro de 17 aminoácidos de BNP, tienen extremos carboxi únicos y resultan de una variación de corte y empalme distinta. Una de las isoformas, BNP2, tiene una única extensión C-terminal de 33 restos de aminoácidos 45 unida al anillo. Esta isoforma es el resultado de la inclusión del intrón 2. El BNP3 contiene una nueva extensión C-terminal de 14 restos de aminoácidos y es el resultado de un aceptor de corte y empalme alternativo presente dentro del intrón 2. Como se describe en el presente documento, la expresión de BNP2 y BNP3 está aumentada en los cardiomiocitos durante la insuficiencia cardiaca. De esta manera, pueden usarse polipéptidos de BNP2 y BNP3 o ácidos ribonucleicos que codifican BNP2 o BNP3 como marcadores para afecciones cardiacas. De esta manera, 50 puede usarse la presencia, ausencia o nivel de dichos polipéptidos o ácidos ribonucleicos para diagnosticar afecciones cardiacas y supervisar el tratamiento de las afecciones cardiacas. Además, el BNP2 y BNP3 pueden usarse como agentes terapéuticos para el tratamiento de afecciones cardiacas.

Se describe un polipéptido purificado y un anticuerpo que tiene afinidad de unión específica por el polipéptido. El polipéptido incluye una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las secuencias de aminoácidos de las SEC ID Nº: 1, 2, 3, 4, 35 o 36; una secuencia que tiene al menos 6 restos contiguos de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 1 o la SEC ID Nº: 2; una secuencia que tiene al menos un 65% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 1 o la SEC ID Nº: 2; y una 5 secuencia que tiene al menos un 65% de identidad de secuencia con un fragmento de la SEC ID Nº: 1 o la SEC ID Nº: 2 de al menos seis restos contiguos de longitud. La secuencia de aminoácidos puede tener al menos un 75% (por ejemplo, un 80, 90 o 95%) de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 1 o la SEC ID Nº: 2, o al menos un 75% (por ejemplo, un 80, 90 o 95%) de identidad de secuencia con un fragmento de la SEC ID Nº: 1 o la SEC ID Nº: 2 de al menos 6 restos contiguos de longitud. El polipéptido puede incluir la secuencia 10 de aminoácidos de la SEC ID Nº: 35 o la SEC ID Nº: 36. Las composiciones farmacéuticas pueden incluir un polipéptido y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Se desvela un ácido nucleico aislado que codifica un polipéptido purificado descrito anteriormente, vectores que incluyen los ácidos nucleicos y células huésped que incluyen los vectores. El polipéptido puede estar codificado por la secuencia de ácido nucleico de la SEC ID Nº: 5; la secuencia de ácido nucleico de los nucleótidos 383 a 489 15 de la SEC ID Nº: 5; la secuencia de ácido nucleico de la SEC ID Nº: 6; o la secuencia de ácido nucleico de los nucleótidos 388 a 432 de la SEC ID Nº: 6. Las células huésped pueden ser células huésped eucariotas.

Se desvela un polipéptido natriurético quimérico. El polipéptido incluye una primera región y una segunda región, teniendo la primera región una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en a) la secuencia de los restos 1 a 27 de la SEC ID Nº: 16; b) la secuencia de los restos 1 a 25 de la SEC ID Nº: 17; c) la 20 secuencia de los restos 1 a 23 de la SEC ID Nº: 18; d) la secuencia de los restos 1 a 22 de la SEC ID Nº: 19; y e) la secuencia de a), b), c) o d) con una a cinco sustituciones de aminoácidos; y teniendo la segunda región una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: f) la secuencia de la SEC ID Nº: 1 o la SEC ID Nº: 2; g) una secuencia que tiene al menos 6 restos contiguos de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 1 o la SEC ID Nº: 2; h) una secuencia que tiene al menos un 65% de identidad de secuencia con la secuencia de 25 aminoácidos de la SEC ID Nº: 1 o la SEC ID Nº: 2; e i) una secuencia que tiene al menos un 65% de identidad de secuencia con un fragmento de la SEC ID Nº: 1 o la SEC ID Nº: 2 de al menos 6 restos contiguos de longitud.

Se desvela un polipéptido purificado que incluye una secuencia de aminoácidos de la fórmula: Gly-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaa10-Xaa11-Xaa12-Xaa13-Xaa14-Xaa15-Xaa16-Xaa17-Xaa18-Xaa19-Xaa20-Xaa21-Xaa22-Xaa23-Xaa24-Xaa25-Xaa26-Xaa27-Xaa28-Gly-Xaa29-Xaa30-Xaa31-Xaa32 (SEC ID Nº: 20), en la que Xaa1 es 30 Glu o Lys; Xaa2 es Pro, His o Arg; Xaa3 es Pro o Leu; Xaa4 es Pro, Leu o Ser; Xaa5 es Cys o Pro; Xaa6 es Pro, His, Gln o Arg; Xaa7 es Arg, Phe o Leu; Xaa8 es Asp, Gly o está...

1. Un polipéptido purificado que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en:

a) la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 2, 4 o 35; y

b) una secuencia que tiene al menos un 65% de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEC 5 ID Nº: 2.

2. El polipéptido de la reivindicación 1, en el que dicha secuencia de aminoácidos tiene al menos un 75%, 80%, 90% o 95% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 2.

3. El polipéptido de la reivindicación 1, en el que dicha secuencia de aminoácidos tiene al menos un 75%, 80%, 90% o 95% de identidad de secuencia con un fragmento de la SEC ID Nº: 2 con una longitud de al menos 6 10 restos contiguos.

4. Un ácido nucleico aislado que codifica dicho polipéptido de la reivindicación 1.

5. El ácido nucleico aislado de la reivindicación 4, en el que dicho polipéptido se codifica por la secuencia de ácido nucleico de la SEC ID Nº: 6, o

la secuencia de ácido nucleico de los nucleótidos 388 a 432 de la SEC ID Nº: 6. 15

6. Un vector que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 5.

7. Células huésped que comprenden el vector de la reivindicación 6.

8. Las células huésped de la reivindicación 7, en las que dichas células huésped son células huésped eucariotas.

9. Una composición farmacéutica que comprende el polipéptido de la reivindicación 1 y un vehículo 20 farmacéuticamente aceptable.

10. Un anticuerpo que tiene afinidad de unión específica por el polipéptido de la reivindicación 1.

11. Un polipéptido natriurético quimérico que comprende una primera región y una segunda región, teniendo dicha primera región una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en:

a) la secuencia de restos 1 a 27 de la SEC ID Nº: 16; 25

b) la secuencia de restos 1 a 25 de la SEC ID Nº: 17;

c) la secuencia de restos 1 a 23 de la SEC ID Nº: 18;

d) la secuencia de restos 1 a 22 de la SEC ID Nº: 19; y

e) la secuencia de a), b), c) o d) con una a cinco sustituciones de aminoácidos; teniendo dicha segunda región una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: 30

f) la secuencia de la SEC ID Nº: 2; y

g) una secuencia que tiene al menos un 65% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 2.

12. Un procedimiento ex vivo para diagnosticar una afección cardiaca en un paciente, comprendiendo dicho procedimiento: 35

a) detectar la presencia, ausencia o nivel de un polipéptido de BNP3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la reivindicación 1 en una muestra biológica de dicho paciente; y

b) clasificar a dicho paciente como un paciente que tiene dicha afección cardiaca o que no tiene dicha afección cardiaca basándose, al menos en parte, en la presencia de dicho polipéptido de BNP3, el nivel de dicho polipéptido de BNP3 o la ausencia de dicho polipéptido de BNP3. 40

13. El procedimiento de la reivindicación 12 o la reivindicación 14, en el que dicha afección cardiaca se

selecciona del grupo que consiste en insuficiencia cardiaca, angina inestable, infarto de miocardio agudo e hipertensión.

14. Un procedimiento ex vivo para diagnosticar una afección cardiaca en un paciente, comprendiendo dicho procedimiento:

a) detectar la presencia, ausencia o nivel de un ácido ribonucleico que codifica un polipéptido de BNP3 5 que comprende la secuencia de aminoácidos de la reivindicación 1 en una muestra biológica de dicho paciente; y

b) clasificar a dicho paciente como un paciente que tiene dicha afección cardiaca o que no tiene dicha afección cardiaca basándose, al menos en parte, en la presencia de dicho ácido ribonucleico que codifica dicho polipéptido de BNP3, el nivel de dicho ácido ribonucleico que codifica dicho polipéptido de 10 BNP3, o la ausencia de dicho ácido ribonucleico que codifica dicho polipéptido de BNP3.

15. Uso de un polipéptido de la reivindicación 2 o un ácido nucleico de la reivindicación 4 o 5 para la preparación de un medicamento para tratar una afección cardiaca en un mamífero.

16. El uso de la reivindicación 15, en el que dicha afección cardiaca se selecciona entre el grupo que consiste en insuficiencia cardiaca, angina inestable, infarto de miocardio agudo e hipertensión. 15

17. El anticuerpo de la reivindicación 18, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

18. Un anticuerpo purificado, en el que dicho anticuerpo se une a un polipéptido de la reivindicación 1 (BNP3), y en el que dicho anticuerpo no se une a un polipéptido de BNP que consiste en la secuencia expuesta en la SEC ID Nº: 16 o a un polipéptido de BNP2 que consiste en la secuencia expuesta en la SEC ID Nº: 3.

19. El anticuerpo de la reivindicación 18, en el que dicho polipéptido de la reivindicación 1 comprende la 20 secuencia definida en la SEC ID Nº: 2.