IDENTIFICACIÓN Y MODIFICACIÓN DE EPÍTOPOS INMUNODOMINANTES EN POLIPÉPTIDOS.

Identificación y modificación de epítopos inmunodominantes en polipéptidos Antecedentes de la invención [0001] Para tratar enfermedades en humanos se utiliza un conjunto de polipéptidos de diferentes orígenes. Si el polipéptido deriva de una fuente heteróloga o no propia, los pacientes desarrollan fácilmente una respuesta inmune al polipéptido. De hecho, en muchos casos, una respuesta inmune al polipéptido es un resultado terapéutico deseado. Sin embargo, existen situaciones en las que una respuesta inmune a un polipéptido destinado al uso terapéutico es indeseable y podría ser muy perjudicial. Por ejemplo, los polipéptidos destinados al uso terapéutico también incluyen polipéptidos que tienen homólogos endógenos o propios. Se cree en general que una respuesta inmune no se genera para polipéptidos propios o endógenos, a excepción del caso de enfermedades autoinmunes. Si se generara una respuesta inmune después de la administración de dichos polipéptidos, podrían resultar en consecuencias adversas incluyendo el desarrollo de una respuesta autoinmune. [0002] Muchos factores contribuyen a respuestas inmune a polipéptidos. La presencia de epítopos inmunodominantes en un polipéptido es uno de los factores claves en las respuestas a anticuerpos. Un epítopo inmunodominante es un epítopo que provoca y une más frecuentemente a anticuerpos en una población humana o animal cuando se compara con otros epítopos. Los epítopos inmunodominantes en polipéptidos se identifican habitualmente después de la administración del polipéptido al humano o animal. [0003] Los epítopos inmunodominantes se han localizado en proteínas utilizando anticuerpos de animales tratados. Por ejemplo, la estafiloquinasa es un polipéptido bacteriano derivado de Staphylococcus aureus y se utiliza para tratar el infarto de miocardio. Dado que la estafiloquinasa es un polipéptido heterólogo o no propio cuando se administra humanos, los pacientes tratados desarrollan fácilmente una respuesta inmune a este polipéptido. Esta respuesta inmune puede dar lugar a reacciones adversas a un tratamiento terapéutico posterior con el polipéptido. Tal como se ha descrito en la Patente de Estados Unidos No. 5,951,980, los epítopos inmunodominantes identificados utilizando anticuerpos de pacientes tratados se pueden modificar para reducir la inmunogenicidad del polipéptido. [0004] En algunos casos, los epítopos inmunodominantes en polipéptidos heterólogos se han enmascarado o modificado para desplazar la respuesta inmune a otros epítopos en el polipéptido. Tal como se ha descrito en la PCT 99/38978, los pacientes que muestran respuestas de anticuerpo a los epítopos IgO e IgE en alérgenos de orígenes heterólogos, tales como cacahuetes, látex y proteínas de los alimentos. Una vez se identifica un epítopo IgE utilizando los anticuerpos del paciente, el epítopo IgE se puede modificar o enmascarar para desplazar la respuesta inmune del epítopo IgE a otros epítopos en el alérgeno. De manera similar, la respuesta inmune a los epítopos inmunodominantes en patógenos, tales como VIH, se puede desplazar a otros epítopos en los patógenos mediante la modificación o enmascaramiento de los epítopos tal como se describe en la Patente de Estados Unidos No. 5,853,724. Una respuesta inmune a estos polipéptidos es aún un resultado deseado. [0005] Los epítopos inmunodominantes también se han identificado en algunas proteínas endógenas o propias asociadas con una enfermedad autoinmune. La tiroide peroxidasa es una molécula endógena asociada con una enfermedad autoinmune de tiroides. Para una revisión, véase, McIntosh, R.S. et al, Thyroid 7:471 (1997). Se han localizado las regiones inmunodominantes en la tiroide peroxidada utilizando anticuerpos de pacientes con una enfermedad autoinmune. Véase, Hobby, P. et al, Endocrinology 141:2018 (2000) y Nishikawa, et al, Endocrinology 137:1000 (1996). Se ha utilizado la localización de estos epítopos para estudiar los factores que podrían contribuir al desarrollo de una enfermedad autoinmune. Véase, Jaume, J.C. et al, J. Clinical Endocrinology 84: 1424 (1999). Los factores que hace que los propios polipéptidos o los endógenos sean inmunogénicos en una enfermedad autoinmune son complejos y no están bien entendidos. Lubin et al. (1997) J. Biol. Chem 272 (48): 30191-5 describe un análisis del epítopo del inhibidor A2 del factor VIII humano mediante mutagénesis de rastreo con alanina. [0006] Un ejemplo de un polipéptido recombinante humano utilizado terapéuticamente es la trombopoyetina humana (TPO). Una TPO recombinante tiene una secuencia que es idéntica a una trombopoyetina humana y es producida en células CHO. La TPO es un factor de crecimiento hematopoyético endógeno que estimula la proliferación y maduración de megacariocitos y la producción de plaquetas. Una TPO humana recombinante está formada de 332 aminoácidos unidos en una única cadena de polipéptido. Aproximadamente en la mitad de la molécula, existe un sitio dibásico de arginina 153 y arginina 154 que dividen la molécula en un epítopo n-terminal y c-terminal. El epítopo n-terminal se denomina el epítopo de EPO por su similitud con la eritropoyetina o también se denomina TPO truncada. El epítopo n-terminal contiene sitios de unión a receptor y representa la parte biológicamente activa de la molécula. El epítopo c-terminal está ampliamente glicosilado. 2 E01988732 08-11-2011   [0007] Las causas principales de la trombocitopenia en pacientes son la producción alterada de plaquetas por la médula ósea, el secuestro de plaquetas en el bazo y la destrucción de plaquetas por las respuestas autoinmunes. La TPO recombinante estimula la producción de plaquetas y está destinada al tratamiento de la trombocitopenia en pacientes que están bajo quimioterapia. Se sabe que los ciclos repetidos de radiación y quimioterapia dan lugar a la mielosupresión que limita la intensidad de la dosis de agentes quimioterapéuticos. La administración de trombopoyetina, especialmente trombopoyetina recombinante, ha dado lugar a una tolerancia mejorada de los pacientes a la quimioterapia, tal como se describe en WO 98/52598. [0008] Sin embargo, si la administración de TPO recombinantes u otros polipéptidos terapéuticos puede dar lugar a una respuesta inmune, los pacientes pueden ser resistentes al tratamiento o pueden desarrollar otras consecuencias adversas. De este modo, existe la necesidad de identificar epítopos inmunodominantes en polipéptidos destinados al uso terapéutico antes de la administración a pacientes y modificar los polipéptidos para reducir la respuesta inmune al polipéptido. Descripción resumida de la invención [0009] Un objetivo de la presente invención es desarrollar métodos de cribado de polipéptidos destinados al uso terapéutico para identificar epítopos inmunodominantes a efectos de reducir la posibilidad de desarrollar una respuesta inmune al polipéptido. [0010] Otro objeto de la invención es diseñar dichos polipéptidos para modificar los epítopos inmunodominantes a efectos de reducir la respuesta inmune a dichos polipéptidos a la vez que se mantiene una actividad terapéutica sustancial cuando se administran in vivo. [0011] Estos y otros objetivos serán evidentes en la descripción en las realizaciones de la invención proporcionadas aquí. [0012] La presente invención se basa en el hallazgo inesperado y sorprendente de que los humanos y animales sin tratar pueden tener anticuerpos preexistentes a un polipéptido destinado al uso terapéutico, tales como polipéptidos recombinantes humanos. También fue sorprendente que los pacientes desarrollan una respuesta de anticuerpo después de la dosificación o administración de estos polipéptidos ya que se creía en general que no se formaría una respuesta inmune a un polipéptido que tenía una secuencia idéntica a la de la proteína endógena o a la propia proteína. Estos hallazgos indicaron la necesidad de cribar polipéptidos destinados al uso terapéutico para identificar epítopos inmunodominantes antes de la administración a pacientes. En un aspecto de la invención, los anticuerpos de pacientes sin tratar con anticuerpos preexistentes al polipéptido se pueden utilizar ventajosamente para identificar epítopos inmunodominantes en polipéptidos antes de administrarse a pacientes. La identificación de epítopos inmunodominantes antes de la aplicación clínica del polipéptido se puede utilizar en el diseño de moléculas menos inmunogénicas. [0013] La presente invención proporciona métodos tal como se define en las reivindicaciones de modificación de un polipéptido para reducir una respuesta inmune al polipéptido, a la vez que se mantiene una actividad terapéutica sustancial. El método implica identificar por lo menos un epítopo inmunodominante en un polipéptido mediante la utilización de un... [Seguir leyendo]

1. Método de modificación de un polipéptido terapéutico, que comprende: (a) identificar por lo menos un epítopo inmunodominante en el polipéptido utilizando un anticuerpo o población de anticuerpos obtenidos de un humano sin tratar o animal sin tratar o una población de los mismos, donde el polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a la secuencia nativa de un homólogo de polipéptido endógeno en el mismo humano o la misma especie de animal o un fragmento biológicamente activo del polipéptido endógeno, donde el anticuerpo o anticuerpos no inhiben sustancialmente una actividad terapéutica del polipéptido; y el epítopo inmunodominante no se localiza en una región del polipéptido que proporciona una actividad terapéutica del polipéptido; y (b) modificar el epítopo inmunodominante para reducir una respuesta inmune al polipéptido a la vez que mantiene una actividad terapéutica sustancial del polipéptido. 2. Método según la reivindicación 1, donde el polipéptido se selecciona del grupo que consiste en trombopoyetina humana, hormonas de crecimiento, citoquinas y receptores. 3. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, donde el animal se selecciona del grupo que consiste en humanos, primates, ganado, cerdos, aves de corral y ratones. 4. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, donde la modificación es una deleción de por lo menos un epítopo inmunodominante. 5. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, donde la modificación es una modificación de por lo menos un aminoácido en el epítopo inmunodominante mediante N-glicosilación o pegilación. 6. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, donde la modificación es una mutación de uno o más aminoácidos en por lo menos un epítopo inmunodominante. 7. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, donde el polipéptido se produce en una fuente no humana. 8. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-7, donde el polipéptido es un anticuerpo humanizado. 9. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-8, donde el epítopo inmunodominante se identifica mediante la unión tanto al anticuerpo como a una población de anticuerpos de un humano sin tratar o animal sin tratar o una población de los mismos y mediante la unión a un anticuerpo o población de anticuerpos de un humano o animal o población de los mismos tratados con el polipéptido terapéutico. 10. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-9, donde la etapa de identificación comprende identificar por lo menos un epítopo inmunodominante en el polipéptido terapéutico utilizando un algoritmo, y confirmar que un epítopo predicho es un epítopo inmunodominante mediante la inmunoreacción de un péptido que tiene la secuencia del epítopo predicho con el anticuerpo o población de anticuerpos específicos para el polipéptido terapéutico de un humano sin tratar o animal sin tratar o población de los mismos. 11. Método según la reivindicación 10, donde la identificación de por lo menos un epítopo inmunodominante comprende: a) proporcionar un grupo de datos del polipéptido terapéutico; b) analizar el grupo de datos con un algoritmo para identificar por lo menos un epítopo predicho en el polipéptido terapéutico. 12. Método según la reivindicación 11, donde el grupo de datos es la secuencia lineal de aminoácidos del polipéptido en una forma legible por una máquina. 13. Método según la reivindicación 11 o la reivindicación 12, donde el algoritmo es un algoritmo que predice epítopos que se unen a proteínas mayores de histocompatibilidad de clase II. 14. Método según cualquiera de las reivindicaciones 11-13, donde el algoritmo está implementado por un ordenador. 15. Método según cualquiera de las reivindicaciones 10-14, que comprende además predecir si el epítopo inmunodominante se une a los alelos HLA DR y DQ. 29 E01988732 08-11-2011   16. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-15, donde la modificación del epítopo inmunodominante comprende modificar una secuencia de ácidos nucleicos que codifica el polipéptido para codificar un polipéptido modificado. 17. Método según la reivindicación 16, donde el polipéptido modificado es producido mediante el cultivo de células transformadas o transfectadas con un vector que contiene el ácido nucleico modificado. E01988732 08-11-2011   Figura 1 31 N-terminal (dominio Epo) Dominio C-terminal Factor principal de maduración de megacariocitos y producción de plaquetas de trombopoyetina (TPO) E01988732 08-11-2011   Figura 2 ug/kg/día Diluyente Recuento de plaquetas (1000/ul) 32 ANTICUERPO + E01988732 08-11-2011 Día de estudio   Figura 3 Transferencia pasiva de anticuerpos anti-TPO en ratones CD-1 Isotipo control Recuento de plaquetas (miles/cm) 33 E01988732 08-11-2011 Día de estudio   Figura 4A Figura 4B Nivel de anticuerpos (FL ODR) Nivel de anticuerpos (TR ODR) % plaquetas basales 34 % plaquetas basales E01988732 08-11-2011   Figura 4C Figura 4D Nivel de anticuerpos (% bloqueo de mpl) Titulación de HU3 % plaquetas basales % plaquetas basales E01988732 08-11-2011   Figura 5 Péptido 15 Péptido 16 Péptido 19 Péptido 24 Péptido 28 % de unión a FL-TPO 36 E01988732 08-11-2011 Concentración de Péptido (ug/ml)   Figura 6 % de unión a FL-TPO 37 E01988732 08-11-2011 Concentración de antisuero anti-péptido # 15 de conejo (% de suero)   Figura 7A 38 E01988732 08-11-2011   Figura 7B 39 E01988732 08-11-2011