EXPRESIÓN ESPECÍFICA DE TEJIDO.

Polímero promotor sintético que comprende dos o más repeticiones de una secuencia reguladora de ADN,

en la que la secuencia de ADN es un elemento regulador específico de tejido y transactivado del promotor del receptor uroquinasa (u-PAR), y se selecciona de entre el grupo que consiste de las áreas de secuencia -190/-171, -148/-124, -152/-128, -152/-130, -152/-135, -154/-128, -154/-130, -154/-135 respecto al sitio de inicio de transcripción

La presente invención se refiere a un elemento regulador sintético para la expresión génica específica de tejido. Asimismo, la invención se refiere a un sistema de expresión específica de tejido tumoral de genes terapéuticos, así como a una composición farmacéutica. 5

Antecedentes de la invención

En la actualidad, uno de los problemas principales en la terapia clínica de tumores es que a partir de células tumorales individuales que quedan en el sitio del que se extirpó quirúrgicamente un tumor primario se inicia el crecimiento de un nuevo tumor. La metástasis de células tumorales antes o después de una operación conduce a problemas similares. En los últimos 20 años, han aparecido numerosos informes 10 de investigación experimental o clínica que demuestra que los tumores malignos invaden tejidos y desarrollan metástasis mediante la digestión de las estructuras de la matriz extracelular y de la membrana basal (para una revisión: Dvorak, 1986; Liotta, 1986). La digestión de las estructuras de la matriz extracelular se encuentra mediada por diversos sistemas de proteasa asociados a tumor (Schmitt et al., 1992), tales como las serina-proteasas, las aspártico-proteasas, las cisteína-proteasas, las treonina-15 proteasas y las metaloproteasas (Schmitt et al., 1992), que provocan una degradación de las estructuras de la matriz, tales como el colágeno o la laminina, mediante la inducción y estimulación de cascadas proteolíticas, así como mediante la interacción con diferentes inhibidores. De esta manea permiten que las células tumorales invadan las estructuras contiguas, así como el sistema vascular. La identidad de los enzimas contributivos no difiere de los enzimas que controlan fisiológicamente la cicatrización de heridas, la 20 inflamación, la embriogénesis o la angiogénesis (Blasi, 1988 y 1993; Dano et al., 1985; Liotta, 1986; Liotta et al., 1991; Markus, 1988). La sobreexpresión de estos enzimas es lo que caracteriza el fenotipo invasivo de las células malignas.

Uno de los sistemas de proteasa asociados a tumores mejor caracterizados es el sistema uroquinasa (u-PA). La serina-proteasa u-PA de 55 kDa activa el plasminógeno en plasmina y de esta 25 manera degrada directa e indirectamente la fibrina, la fibronectina, los proteoglicanos, la laminina y el colágeno de tipo IV (estos últimos son los componentes de la membrana basal; Andreasen et al., 1994; Duffy, 1992; Guenzler et al., 1982a y 1982b; Wun et al., 1982a y 1982b; Gronow y Bliem, 1993; Vassalli et al., 1984), favoreciendo de esta manera la invasión de células de las estructuras contiguas.

La actividad de u-PA se encuentra modulada por diversas interacciones de otras proteasas o 30 sistemas inhibidores. Por una parte estos factores son activadores o inhibidores de u-PA (catepsina, α-1-antitripsina, antitrombina III), sustratos de u-PA (plasminógeno, MMP-2/colagenasa IV de 72 kD), activadores paralelos (t-Pa) o antagonistas del sistema activador del plasminógeno de u-PA (α-2-macroglobulina) y cofactores que estabilizan los receptores específicos de u-PA en la superficie celular, así como su regulación transcelular (α-1-antiquimotripsina, α-2-macroglobulina; para una revisión ver, por 35 ejemplo, Schmitt et al., 1992; Allgayer et al., 1997).

La actividad específica de u-PA resulta amplificada en un factor elevado por la unión al receptor específico (u-PAR). U-PAR, un receptor de superficie celular glucosilado de 45 a 60 kDa, concentra el efecto proteolítico de u-PA por su elevada flexibilidad en la membrana, debida a un anclaje glucolipídico (Ellis et al., 1991; Behrendt et al., 1990; Estreicher et al., 1990; Ploug et al., 1991a; Moller et al., 1992). La u-40 PA unida a receptor presenta una Km 40 veces inferior para el plasminógeno que para el enzima libre (Ellis et al., 1991).

El complejo u-PA/u-PAR resulta internalizado en una célula mediante la unión específica de un inhibidor, PAI-1, y la interacción con el receptor α-2-macroglobulina. A continuación, los ligandos resultan degradados en lisosomas y el u-PAR libre recircula hasta la superficie celular de modo que se encuentra 45 disponible para la unión con una nueva molécula de u-PA (Olson et al., 1992; Cubellis et al., 1990; Conese et al., 1994; Nykiaer et al., 1992, 1994a, 1994b). Esto resulta en un sistema proteolítico flexible, dinámico y altamente eficiente.

Debido a la estrecha interacción entre u-PAR, su ligando u-PA y también los inhibidores PAI-1 o PAI-2, el conjunto entero probablemente se denominará "sistema u-PA" (Blasi, 1993). 50

El u-PAR comprende 3 dominios de proteína similares (cada uno de aproximadamente 90 aminoácidos, Riittinen et al., 1996) y se expresa fisiológicamente en cantidades reducidas en leucocitos periféricos, monocitos activados y linfocitos T, pre-leucocitos maduros de la médula ósea y durante la cicatrización de heridas en células endoteliales y queratinocitos (Cubellis et al., 1990; Min et al., 1992; Vassalli et al., 1984, 1985; Plesner et al., 1994; Allgayer et al., 1997b; Langer et al., 1993; Romer et al., 55 1994a). De acuerdo con lo anteriormente expuesto, u-PAR desempeña un importante papel en procesos como la quimiotaxis, la migración, la adhesión y la transducción de señales de la construcción del citoesqueleto (May et al., 1998; Dewerchin et al., 1996; Pedersen et al., 1996; Resnati et al., 1996; Xue et al., 1997; Wie et al., 1994, 1996; Busso et al., 1994; Tang et al., 1998; Stahl y Müller, 1995; Bohuslav et al., 1995; Konakova et al., 1998; Yebra et al., 1996). 60

Además, el u-PAR se sobreexpresa en diversos tumores de origen epitelial en comparación con células no tumorales del mismo origen. Principalmente deben mencionarse los tumores del sistema gastrointestinal (carcinoma de estómago o de colon), carcinoma de la glándula prostática o carcinoma bronquial u ovárico (Jankun et al., 1993; Sier et al., 1993; Pyke et al., 1991; Heiss et al., 1995b; Allgayer et al., 1998b; Cantero et al., 1997; Romer et al., 1994b; Morita et al., 1998; Jänicke et al., 1993; Nekarda et al., 5 1994).

Por ejemplo, en un carcinoma de colon existe una clara correlación entre la cantidad de u-PAR endógeno y la invasividad de las células tumorales (Hollas et al., 1991; Schlechte et al., 1989). Los anticuerpos contra u-PAR eran capaces de reducir la destrucción de la matriz extracelular en células HT29 en aproximadamente 80% (Reiter et al., 1993). Pyke et al., (1991a, 1991b) postularon que, en el carcinoma 10 de colon, existe una interacción paracrina de las células del estroma circundantes a un tumor, debido a que habían observado una expresión de u-PAR exclusivamente en células tumorales y una secreción de u-PA y PAI-1 en células de estroma circundantes.

Según algunas publicaciones, la magnitud de la expresión de u-PAR es, por lo tanto, un criterio de invasividad o del fenotipo maligno de las células (Wang et al., 1994; Bianchi et al., 1994; Hollas et al., 1991; 15 Sliutz et al., 1996).

Además, diversos modelos de invasión in vitro han demostrado que la transfección de una línea celular tumoral con vectores de expresión de u-PAR resulta en una invasividad incrementada en membranas de matrigel o en membranas corioalantoicas. En contraste con lo anterior, también se ha demostrado que la inhibición de la expresión génica de u-PAR reduce la invasión de las células (Kariko et 20 al., 1993; Ossowski et al., 1988; Kook et al., 1994; Quattrone et al., 1995).

Además, se ha demostrado que una expresión incrementada de u-PAR estimula el crecimiento tumoral. Se cree que u-PAR en combinación con u-PA da soporte externamente a la invasión de la célula, mientras que simultáneamente u-PAR/u-PA en combinación lanza una señal de MAP-quinasa hacia el interior que estimula la proliferación de las células tumorales (Aguirre-Ghiso et al., 1999). 25

En resumen, el sistema u-PA aparentemente es un punto de partida ideal para una potencial terapia tumoral. Por ejemplo, la inhibición de la actividad de u-PA se percibe como una estrategia terapéutica prometedora no sólo con respecto a una terapia antiinvasiva (Quattrone et al., 1995; Cavallaro et al., 1993), sino también con respecto a una prevención del establecimiento de células tumorales residuales mínimas que se convierten en metástasis (Osborne y Rosen, 1994; Riethmüller et al., 1992; 30 Schlimok et al., 1990).

La patente US nº 5.519.120 describe, por ejemplo, una estrategia terapéutica para inhibir el sistema u-PA con anticuerpos monoclonales o policlonales dirigidos contra u-PAR libre, así...

1. Polímero promotor sintético que comprende dos o más repeticiones de una secuencia reguladora de ADN, en la que la secuencia de ADN es un elemento regulador específico de tejido y transactivado del promotor del receptor uroquinasa (u-PAR), y se selecciona de entre el grupo que consiste de las áreas de secuencia -190/-171, -148/-124, -152/-128, -152/-130, -152/-135, -154/-128, -154/-130, -154/-135 respecto al 5 sitio de inicio de transcripción.

2. Polímero promotor sintético según la reivindicación 1, en el que la secuencia reguladora de ADN comprende por lo menos una copia de la secuencia SEC ID nº 1.

3. Polímero promotor sintético según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en el que las repeticiones de la secuencia reguladora de ADN se encuentran separadas por un espaciador. 10

4. Vector que comprende un gen marcador o un gen terapéutico bajo el control regulador del polímero promotor sintético según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

5. Virus recombinante que comprende un gen marcador o un gen terapéutico bajo el control regulador del polímero promotor sintético según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

6. Virus recombinante según la reivindicación 5, en el que el virus es un virus adenoasociado (AAV), 15 un adenovirus o un retrovirus.

7. Composición farmacéutica que comprende el vector según la reivindicación 4 o virus recombinante según la reivindicación 5 ó 6, y un aditivo, adyuvante o diluyente farmacéuticamente aceptable.

8. Vector según la reivindicación 4 o el virus recombinante según la reivindicación 5 ó 6 para la utilización como medicamento. 20