La invención se relaciona con una proteína termófila con actividad esterasa.

Dicha proteína, del organismo Thermus thermophilus, se expresa en bacterias y levaduras recombinantes, en particular en E.coli, K.lactis y S.cerevisae. Dicha esterasa se expresa en forma de proteína de fusión con una secuencia señal que permite la secreción al medio de cultivo y, además, se encuentran operativamente ligadas a un promotor inducible. Las cepas recombinantes tienen las ventajas de que (i) su cultivo es mucho más fácil que el del organismo termófilo del que procede la enzima y (ii) permiten obtener un mayor número de unidades enzimáticas por litro de cultivo que las cepas termófilas originales

Esterasa termófila de Thermus thermophilus.

Campo técnico de la invención

La presente invención se refiere a enzimas termófilas, en particular a esterasas termófilas, de Thermus thermophilus que pueden expresarse en organismos mesófilos.

Antecedentes de la invención

Las enzimas son catalizadores muy potentes, selectivos y muy específicos. El término esterasa es un término general para denotar una enzima de tipo hidrolasa que hidroliza enlaces de tipo éster para producir alcoholes y ácidos carboxílicos.

Las aplicaciones que tienen las hidrolasas, y en particular las esterasas, en la industria actual son múltiples, por ejemplo, el ibuprofeno, un agente antiinflamatorio no esteroideo se ha sintetizado mediante una hidrólisis estereo-selectiva de su metil-éster mediante el empleo de una carboxiesterasa. La mayor aplicación industrial de las hidrolasas, en particular las esterasas, incluyen la industria de detergentes donde se emplean para descomponer materia grasa en sustancias hidrofílicas fácilmente eliminables.

El mayor requisito para una enzima comercial es su estabilidad térmica porque la desnaturalización térmica es una causa común de la inactivación enzimática. Adicionalmente, mediante el incremento en la termoestabilidad enzimática se podrían llevar a cabo reacciones enzimáticas a mayor temperatura, lo que podría ayudar para aumentar los ratios de conversión, la solubilidad del sustrato y reducir la posibilidad de crecimiento microbiano y la viscosidad en el medio de reacción. En el procesado de los alimentos, desde un punto de vista de higiene, las reacciones enzimáticas a altas temperaturas son menos peligrosas para la contaminación por bacterias. En la descomposición de grasas y aceites, actualmente se emplean métodos en los que las grasas y aceites se ponen en contacto con vapor a temperaturas de aproximadamente 250°C y a presiones de aproximadamente 50 atmósferas, lo que implica la necesidad de disponer de instalaciones adecuadas para llevar a cabo tales reacciones. Grasas como el ácido palmítico o el ácido esteárico son sólidas a temperatura ambiente y tienen puntos de fusión de aproximadamente 65°C. Por ello, las reacciones de hidrólisis deben llevarse a cabo a temperaturas por encima de dicho punto de fusión.

La disponibilidad de esterasas termofílicas permitiría operar a altas temperaturas, con el lógico incremento de la velocidad de reacción y una más fácil solubilización de los sustratos, aspecto que constituye con frecuencia un factor limitante en algunas aplicaciones de este tipo de enzimas (p.ej. reacciones de síntesis en medios con bajo contenido en agua).

Los microorganismos extremófilos han despertado un gran interés durante los últimos años, debido a la elevada estabilidad térmica, resistencia a desnaturalizantes químicos y pHs extremos de sus enzimas, que las hacen especialmente adecuadas para su uso en procesos de biotransformación en condiciones extremas de pH, salinidad y temperatura. Los microorganismos termófilos crecen a temperaturas superiores a 45°C, y en algunos casos (hipertermófilos) incluso por encima de 90°C.

Aunque los organismos termófilos pueden ser buenos candidatos en producir enzimas termoestables, muchas veces no resulta práctico debido al bajo rendimiento y al equipo de fermentación de alta temperatura que sería necesario emplear.

La producción de enzimas de interés biotecnológico procedentes de microorganismos termófilos extremos suele efectuarse mediante su clonado y expresión a alto nivel en una bacteria o levadura modelo fácilmente manipulable, tal como Escherichia coli o Saccharomyces cerevisiae. Sin embargo, existen una gran cantidad de enzimas termófilas cuya complejidad de síntesis hace imposible su obtención en forma activa en estos organismos modelo (Hidalgo, A. y cols., 2004. Appl. Environ. Microbiol. Vol. 70 (7): 3839-3844). Este es el caso frecuente de enzimas hetero-oligoméricas o el de aquellas enzimas que requieren la incorporación de un cofactor en el proceso de síntesis, que suele requerir la ayuda de chaperonas específicas que mantienen la estructura de la enzima en posición abierta para la entrada del mencionado cofactor. En tales casos, que pueden llegar a constituir hasta el 50% de las enzimas codificadas en cualquier termófilo, la alternativa evidente es la de utilizar en la producción un microorganismo termófilo relacionado evolutivamente con aquel del que procede la enzima de interés.

Las bacterias del género Thermus spp. se caracterizan por su capacidad para crecer a altas temperaturas y por su facilidad de manipulación genética, única entre organismos termófilos extremos. Las bacterias del género Thermus spp. tienen gran potencial de utilización como sistemas de obtención de enzimas termoestables mediante selección funcional a elevadas temperaturas, existiendo algunos ejemplos de ello en la literatura científica (Fridjonsson y cols., 2002. J Bacteriol. Vol. 184:3385-3391; Brouns y cols., 2005. J Biol Chem. Vol. 280:11422-31). No obstante, la aplicación de estos métodos depende de la generación de una cepa de Thermus spp. mutante que requiera de la actividad funcional de la enzima a termoestabilizar para su crecimiento, siendo muy limitadas en la actualidad las metodologías existentes para la obtención de dichos mutantes.

La solicitud de patente internacional WO9725058 describe el aislamiento, caracterización y purificación de esterasas de Thermus sp. T351 (ATCC 31674). Dichas enzimas pueden expresarse en organismos mesófilos tales como Escherichia coli a partir de la infección de dichas células con vector de expresión que codifica para dicha enzima, tal como el fago lambda. Por otro lado, el documento WO2006082059 describe la expresión de una enzima con actividad esterasa de Alicyclobacillus acidocaldarius en vectores de expresión que comprenden la secuencia de nucleótidos que codifican dicha enzima en forma de proteína de fusión. Dicha esterasa es particularmente útil como marcador de actividad proteica en sistemas de síntesis de proteínas libres de células (cell-free translation system) o en sistemas in vivo, tales como E. coli o células de levadura.

Por otra parte, Fuciños P., et al (J Biotechnology, (2005) 117; 233-241) describen la identificación de enzimas extracelulares con actividad lipasa/esterasa producidas en cultivos de Thermus thermophilus HB27. Dichos autores describen la purificación parcial y caracterización bioquímica preliminar de las mismas a nivel de actividad y estabilidad a altas temperaturas (80-90°C). Sin embargo, el grado de purificación de dichas enzimas es muy bajo (factor de purificación de 4 con respecto al homogeneizado celular) y por otra parte, dichos autores no describen la secuencia aminoacídica de dichas proteínas.

Por tanto, existe la necesidad de encontrar nuevas enzimas termófilas con actividad esterasa que presenten estabilidad a elevadas temperaturas y que puedan expresarse en organismos mesófilos.

Compendio de la invención

En un primer aspecto, la invención se refiere a un polipéptido aislado con actividad esterasa que comprende la secuencia de aminoácidos identificada en la SEQ ID NO: 1 o una variante funcionalmente equivalente del mismo.

En un segundo aspecto, la invención se refiere a una proteína de fusión que comprende

i) un polipéptido según la invención; y

ii) un péptido heterólogo.

En un tercer aspecto, la invención se relaciona con una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido o una proteína de fusión según la invención.

En otro aspecto, la invención también se relaciona con una construcción génica que comprende una secuencia de nucleótidos según la invención.

En un aspecto adicional, la invención se relaciona con un vector de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos o una construcción génica según la invención.

En otro aspecto, la invención se refiere a una célula que comprende una secuencia de nucleótidos, una construcción génica o un vector de expresión según la invención.

En otro aspecto, la invención se refiere a una composición que comprende un polipéptido según la invención o una proteína de fusión según la invención.

En otro aspecto, la invención también se refiere a un procedimiento para la obtención de un polipéptido con actividad esterasa que... [Seguir leyendo]

1. Un polipéptido aislado con actividad esterasa que comprende la secuencia de aminoácidos identificada en la SEQ ID NO: 1 o una variante funcionalmente equivalente del mismo.

2. Polipéptido según la reivindicación 1, donde dicha esterasa es una esterasa termófila.

3. Polipéptido según la reivindicación 2, donde dicha esterasa termófila es estable a una temperatura comprendida entre 60 y 90°C.

4. Una pro teína de fusión que comprende

i) un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3; y

ii) un péptido heterólogo.

5. Proteína de fusión según la reivindicación 4, donde dicho péptido heterólogo es un péptido señal de secreción extracelular.

6. Polipéptido o proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde dicha proteína de fusión comprende, además, un péptido de purificación.

7. Polipéptido o proteína de fusión según la reivindicación 6, donde dicho péptido de purificación se selecciona entre un péptido Flag o una cola de polihistidinas.

8. Una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o una proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7.

9. Una construcción génica que comprende una secuencia de nucleótidos según la reivindicación 8.

10. Un vector de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos según la reivindicación 8 o una construcción génica según la reivindicación 9.

11. Vector de expresión según la reivindicación 10, que comprende, además, la secuencia de nucleótidos de un promotor.

12. Vector de expresión según la reivindicación 11, donde dicho promotor es un promotor inducible o reprimible.

13. Vector de expresión según la reivindicación 12, donde dicho promotor es un promotor inducible por galactosa o lactosa.

14. Vector de expresión según la reivindicación 12, donde dicho promotor es un promotor inducible por IPTG.

15. Vector de expresión según la reivindicación 12, donde dicho promotor es un promotor que se reprime en presencia de glucosa.

16. Una célula que comprende una secuencia de nucleótidos según la reivindicación 8 o una construcción génica según la reivindicación 9 o un vector de expresión según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 15.

17. Célula según la reivindicación 16, donde dicha célula se selecciona entre una bacteria y una levadura.

18. Célula según la reivindicación 17, donde dicha bacteria es Escherichia coli.

19. Célula según la reivindicación 17, donde dicha levadura se selecciona entre Saccharomyces cerevisiae y Kluyveromyces lactis.

20. Una composición que comprende un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o una proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7.

21. Un procedimiento para la obtención de un polipéptido con actividad esterasa o una variante funcionalmente equivalente del mismo que comprende cultivar una célula según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 19 bajo condiciones que permiten la producción de dicho polipéptido y, si se desea, recuperar dicho polipéptido.

22. Procedimiento según la reivindicación 21, donde cuando dicho polipéptido con actividad esterasa comprende la secuencia de aminoácidos de un péptido de secreción extracelular, la recuperación de dicho polipéptido se realiza a partir del medio de cultivo.

23. Uso de un polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o una proteína de fusión según una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7 en la elaboración de una composición detergente.

24. Método para la modificación de grasas o aceites que comprende poner en contacto un polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o una proteína de fusión según una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7 con una grasa o aceite en condiciones donde dicho polipéptido o proteína de fusión pueda hidrolizar dicha grasa o aceite.