ESCISIÓN DE PRECURSORES DE INSULINAS MEDIANTE UNA VARIANTE DE TRIPSINA.

Escisión de precursores de insulinas mediante una variante de tripsina La presente invención se refiere a la producción de una variante de tripsina recombinante con especificidad incrementada del sustrato para arginina frente a lisina en organismos huéspedes no animales. Además, la presente invención se refiere a una variante de tripsina recombinante y a su producción. También se proporciona el uso de variantes de tripsina pancreática porcina recombinante para la escisión de precursores de insulinas, y kits que contienen la variante de tripsina. La tripsina es una serina proteasa que cataliza la escisión hidrolítica de péptidos en el grupo carboxilo de los aminoácidos básicos arginina y lisina (Keil B., (1971). The Enzyme Vol II, 3ª Edición, Editor Boyer, Acad. Press NY. Págs. 249-275). La tripsina pancreática porcina recombinante tiene un peso molecular de aproximadamente 23.000 daltons y un óptimo de actividad enzimática a pH 8,0. La tripsina se utiliza en el proceso industrial para producir insulina y análogos de insulina. La producción de estas biomoléculas se describe en la bibliografía y se han elegido varios enfoques. Desde un punto de vista económico, no es factible la síntesis química de insulina humana y análogos de insulina. Por lo tanto, actualmente existen principalmente dos procedimientos para la producción de insulina y análogos de insulina, a saber el enfoque semi- sintético utilizando insulina porcina como material de partida, y el uso de microorganismos genéticamente modificados para la expresión de insulina recombinante. La insulina es un polipéptido de 51 aminoácidos, los cuales se dividen en 2 cadenas de aminoácidos: la cadena A, que tiene 21 aminoácidos, y la cadena B, que tiene 30 aminoácidos. Las cadenas están conectadas una a otra por medio de 2 puentes disulfuro. Las preparaciones de insulina se han empleado para la terapia de diabetes durante muchos años. Aquí no sólo se utilizan insulinas existentes en la naturaleza, sino recientemente también derivados y análogos de insulina. Los análogos de insulina son análogos de insulinas existentes en la naturaleza, a saber la insulina humana o insulinas animales, que difieren por la sustitución de al menos un resto aminoácido existente en la naturaleza con otros restos aminoácidos y/o la adición/separación de al menos un resto aminoácido de la insulina correspondiente, por lo demás idéntica, existente en la naturaleza. Los restos aminoácidos añadidos y/o reemplazados pueden ser también aquellos que no existen en la naturaleza. Los derivados de insulina son derivados de insulina o un análogo de insulina existentes en la naturaleza, los cuales se obtienen por modificación química. La modificación química puede consistir, por ejemplo, en la adición de uno o más grupos químicos específicos a uno o más aminoácidos. Ejemplos de derivados de insulina son insulina humana B29-N-miristoil-des(B30), insulina humana B29-N-palmitoildes(B30), insulina humana B29-N-miristoílo, insulina humana B29-N-palmitoílo, insulina humana B28-N-miristoil- Lys B28 Pro B29 , insulin humana B28-N-palmitoil-Lys B28 Pro B29 , insulina humana B30-N-miristoil-Thr B29 Lys B30 , insulina humana B30-N-palmitoil-Thr B29 Lys B30 , insulina humana B29-N-(N-palmitoil--glutamil)-des(B30), insulina humana B29-N-(N-litocolil--glutamil)-des(B30), insulina humana B29-N-(-carboxiheptadecanoil)-des(B30) e insulina humana B29-N-(-carboxiheptadecanoílo). Análogos de insulina se describen en los documentos EP 0 214 826, EP 0 375 437 y EP 0 678 522. El documento EP 0 214 826 se refiere, entre otros, a sustituciones de B27 y B28. El documento EP 0 678 522 describe análogos de insulina que tienen diversos aminoácidos, preferiblemente prolina, en la posición B29, pero no ácido glutámico. Otros análogos de insulina son insulina humana Lys B28 Pro B29 , insulina humana B28 Asp, insulina humana en la que prolina en la posición B28 ha sido sustituida con Asp, Lys, Leu, Val o Ala y en la que en la posición B29 Lys puede estar sustituida con Pro; insulina humana AlaB26; insulina humana des(B28-B30); insulina humana des(B27) o insulina humana des(B30). El documento EP 0 375 437 incluye análogos de insulina con lisina o arginina en B28, que pueden estar opcionalmente modificados adicionalmente en B3 y/o A21. En el documento EP 0 419 504 se describen análogos de insulina que están protegidos frente a modificaciones químicas, en las que están modificados la asparagina en B3 y al menos un aminoácido más en las posiciones A5, A15, A18 o A21. En el documento WO 92/00321 se describen análogos de insulina en los que al menos un aminoácido de las posiciones B1-B6 está reemplazado por lisina o arginina. Importantes análogos de insulina comentados en esta memoria adicionalmente son insulina glargina (insulina humana Gly A(21), Arg B (31), Arg B (32)) e insulina glulisina (insulina humana Lys B(3), Glu B(29)). 2   Procedimientos de ADN recombinante permiten preparar en microorganismos precursores de insulina o análogos de insulina, en particular proinsulina humana o proinsulina que tiene una secuencia de aminoácidos y/o una longitud de cadena de los aminoácidos que difieren de la insulina humana. Las proinsulinas preparadas a partir de células de Escherichia coli genéticamente modificadas no tienen puentes cisteína correctamente unidos. Un procedimiento para obtener insulina humana utilizando E. coli (documento EP 0 055 945) se basa en las siguientes etapas de procedimiento: Frmentación del microorganismo, separación de células, disgregación de células, aislamiento del precursor de insulina o análogo de insulina, re-plegamiento a la estructura tridimensional (nativa) deseada mediante la formación de los respectivos puentes disulfuro para proporcionar la o las pre-pro-insulinas (PPI), la escisión tríptica de la respectiva pre-pro-insulina (posiblemente en presencia de carboxipeptidasa B), purificación básica, primera etapa cromatográfica, escisión enzimática final para proporcionar insulina humana o el respectivo análogo de insulina, segunda etapa cromatográfica y purificación final mediante HPLC, cristalización y secado. La escisión tríptica de las pre-pro-insulinas es una reacción enzimática y compleja: la pre-secuencia y el péptido C se separan por escisión en esta etapa con el fin de proporcionar los productos respectivos. Por ejemplo, en el caso de la producción de insulina humana, los componentes valiosos deseados son insulina Arg(B31),Arg(B32) e insulina Arg(B31) (documento DE19821866). Sin embargo, la escisión tríptica conduce a la formación de muchos productos secundarios como resultado de la ocurrencia de reacciones secundarias indeseadas. La tripsina es una endoproteasa (tipo serina) que escinde los enlaces péptido en los restos arginina (Arg) o lisina (Lys) C-terminales. La escisión tríptica de moléculas de pre- pro-insulina puede producirse simultáneamente en diferentes sitios de escisión. Debido a los muchos sitios de escisión dentro de una molécula de pre-pro-insulina específica, se pueden formar muchos productos secundarios indeseados durante la reacción de escisión tríptica. Como se puede ver en la Figura 1, muchos de los productos secundarios generados durante las reacciones de escisión son una consecuencia de la escisión del enlace péptido en el lado C-terminal de restos Lys en lugar de restos Arg. Para todas las pre-pro-insulinas, el sitio de escisión entre la pre-secuencia y la cadena B de la insulina es monobásico. En esta unión, sólo puede producirse una reacción de escisión. En las otras dos uniones cadena B/péptido C y péptido C/cadena A existen diferentes sitios de escisión. En el caso de la insulina humana y la insulina glargina los sitios de escisión entre cadena B/péptido C y péptido C/cadena A son ambos dibásicos (Arg-Arg y Lys-Arg, respectivamente). Además, la escisión detrás de B29-Lys conduce a la formación de B30-des-Thr ("des-Thr"). Para la insulina humana solamente la escisión tríptica detrás de los restos B31-Arg y B32-Arg proporciona productos valiosos para la unión cadena B/péptido C, a saber insulina B31-Arg ("mono-Arg") e insulina B31-Arg, B32-Arg ("di-Arg"). Estos productos pueden resumirse como "insulinas Arg". La escisión detrás de B32-Arg es crucial en el proceso para producir insulina glargina, ya que solamente se puede utilizar insulina Di-Arg. Para la insulina humana e insulina glargina, la escisión detrás de B29-Lys resulta en la formación de des-Thr. Para la insulina glulisina, este sitio de escisión es monobásico y productos posibles son especies que contienen Arg. En relación con el péptido C/cadena A, la escisión tríptica detrás del resto Arg y no del resto Lys es crucial para proporcionar valiosos productos. La escisión falsa detrás de Lys resulta en la formación de productos secundarios A0. Con el fin... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento para preparar insulina, un análogo de insulina o un derivado de insulina, en el que (a) una pre-pro-insulina, un análogo de pre-pro-insulina o un derivado de pre-pro-insulina se escinde con tripsina porcina Ser172Ala caracterizada por la SEQ ID NO. 3, (b) los productos de la escisión resultantes se separan y (aa) si uno de los productos de la escisión resultantes es un análogo de insulina o un derivado de insulina, se obtiene este análogo de insulina o derivado de insulina, o (cc) siendo esos productos de la escisión precursores de insulina, un análogo de insulina o un derivado de insulina se procesan adicionalmente, y la insulina, el análogo de insulina o el derivado de insulina que resultan de dicho procesamiento adicional se separa y se obtiene. 2. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la insulina es insulina humana. 3. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el análogo de insulina se selecciona de un grupo que comprende insulina humana Lys B28 Pro B29 , insulina humana B28 Asp, insulina humana en la que prolina en la posición B28 ha sido sustituida con Asp, Lys, Leu, Val o Ala y en que en la posición B29 Lys puede estar sustituida con Pro; insulina humana AlaB26; insulina humana des(B28-B30); insulina humana des(B27) e insulina humana des(B30). 4. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el análogo de insulina es insulina glulisina. 5. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el análogo de insulina es insulina glargina. 6. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el derivado de insulina se selecciona del grupo que comprende insulina humana B29-N-miristoil-des(B30), insulina humana B29-N-palmitoildes(B30), insulina humana B29-N-miristoílo, insulina humana B29-N-palmitoílo, insulina humana B28-Nmiristoil-Lys B28 Pro B29 , insulina humana B28-N-palmitoil-Lys B28 Pro B29 , insulina humana B30-N-miristoil- Thr B29 Lys B30 , insulina humana B30-N-palmitoil-Thr B29 Lys B30 , insulina humana B29-N-(N-palmitoil-glutamil)-des(B30), insulina humana B29-N-(N-litocolil--glutamil)-des(B30), insulina humana B29-N-(carboxiheptadecanoil)-des(B30) e insulina humana B29-N-(-carboxiheptadecanoílo). 7. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 y 6, en el que el procesamiento adicional de los productos de la escisión que son precursores de insulina, un análogo de insulina o un derivado de insulina comprende una escisión de dichos productos con carboxipeptidasa B. 8. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que la escisión con tripsina porcina Ser172Ala se efectúa a un valor del pH en el intervalo de 7,5 a 9,5; una temperatura entre 1°C y 30°C; y la reacción enzimática se detiene al acidificar la muestra. 9. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 8, en el que la escisión se efectúa a un valor del pH de 8,3; una temperatura entre 8 y 12 °C y la acidificación se lleva a cabo añadiendo soluciòn de HCl 1N ó 2N. 10. Tripsina porcina Ser172Ala, caracterizada por la secuencia SEQ ID. NO: 3. 11. ADN que codifica tripsina porcina Ser172Ala caracterizada por la secuencia SEQ ID. NO: 3. 12. ADN de acuerdo con la reivindicación 11, caracterizado por la secuencia SEQ ID. NO: 4. 13. ADN que codifica tripsinógeno porcino Ser196Ala caracterizada por la secuencia SEQ ID. NO: 6. 14. Un vector que comprende un ADN de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11, 12 ó 13. 15. Un método para producir tripsina porcina Ser172Ala caracterizada por la secuencia SEQ ID. NO: 3, que comprende las etapas de (a) proporcionar un vector de acuerdo con la reivindicación 14, (b) transformar con el vector una cepa huésped microbiana, 23   (c) cultivar la cepa huésped microbiana transformada en un medio de crecimiento que contiene nutrientes, con lo que la cepa huésped microbiana expresa la tripsina porcina Ser172Ala o el tripsinógeno porcino Ser196Ala, (d) en el caso de que el producto de expresión de (c) sea tripsinógeno porcino Ser196Ala, conversión en tripsina porcina Ser172Ala madura, y (e) purificar la tripsina porcina Ser172Ala a partir de la cepa huésped microbiana y/o el medio de crecimiento. 16. Un método de acuerdo con la reivindicación 15, en el que la cepa huésped microbiana es una cepa de levadura metilotrófica seleccionada de un grupo que comprende especies de Hansenula, Pichia, Candida y Torulopsis. 17. Un método de acuerdo con la reivindicación 16, en el que la cepa huésped microbiana se selecciona de un grupo que comprende Pichia pastoris, Hansenula polymorpha, Candida boidinii y Torulopsis glabrata. 24     26   27   28   29