DIAGNÓSTICO DE FASCIÓLOSIS MEDIANTE PRUEBA DE PIEL (INTRADERMOREACCIÓN) UTILIZANDO EL ANTÍGENO FH8 (FASCIOLINA).

Un antigeno Fh8 como se describe en la Figura 2 para uso en un metodo de diagnostico practicado en el cuerpo de animal o de humano,

en donde el metodo es para reconocer un anfitrion definitivo infectado por o expuesto previamente a F. hepatica que involucra una aplicacion en la piel o intradermica de una cantidad efectiva del antigeno Fh8 y despues de un periodo necesario obtener una respuesta de hipersensibilidad inmediata como una papula de piel con relevancia para propositos de diagnostico por su tamano y elasticidad de la piel

Antecedente de la invención:

La fasciólosis es una enfermedad antropozoonótica originada por el tremátodo Fasciola hepatica. Este gusano es un parásito común en los rumiantes a saber ovejas, cabras y ganado. Los gusanos adultos se encuentran usualmente en los conductos biliares del hígado anfitrión, originando pérdidas económicas significativas en la industria de la ganadería (Boray, 1969).

Los casos humanos de fasciólisis no son comunes pero se han descrito alrededor del mundo. En Portugal la fasciólisis humana es un problema de salud público y en varios sitios se ha reportado y estudiado. (Chen y Kenneth, 1990; Sampaio Silva et al., 1980)

Las introducciones de nuevos métodos han mejorado el diagnóstico de fasciólisis humana (Sampaio Silva et al., 1996; Silva et al. 2004) y el uso de herramientas diagnósticas serológicas y parasitológicas complementarias permite la detección de la mayoría de los casos.

En la producción Animal, el diagnóstico se basa más frecuentemente luego de la detección del gusano y las lesiones en el hígado en los mataderos. Las herramientas de diagnóstico disponibles para fasciólisis de animal han mejorado significativamente con el uso de más antígenos específicos y métodos sensibles. No obstante la mayoría de herramientas de diagnóstico muestran baja sensibilidad

o especificidad (Boulard et al., 1985; Ibarra et al., 1998) que obstaculizan la implementación de un diagnóstico sistémico de la enfermedad en animales de granja.

Gomez Arroyo et al., en 1984 desarrolló un método de diagnóstico para la detección de fasciólisis de ovino utilizando antígenos derivados de un extracto de F. hepatica de origen bovino. En la presente invención en lugar de un extracto de antígeno Fh8 o un antígeno relacionado con Fh8 se utiliza en una prueba intradérmica y una pápula se desarrolla inmediatamente como una consecuencia de la respuesta de hipersensibilidad del animal.

El gusano adulto F. hepatica de antígenos excretados/secretados (ESA) ha mostrado ser útil en el diagnóstico de fasciólisis humana, ya que su uso tienen sensibilidad y especificidad significativamente mejorada en las pruebas (Sampaio Silva et al., 1996). Más aún, varios autores han descrito la aplicación de ESA en el serodiagnóstico de fasciólisis de ganado y ovejas. Actualmente no hay herramientas diagnósticas disponibles para uso en el campo.

Debido a su interés diagnóstico e inmunoprofiláctico llevamos a cabo el aislamiento de varios clones cADN que codifican los homólogos de antígeno para proteínas ESA (Castro, 2001; Eguino et al., 1999; Salazar-Caldéron et al., 2000; Silva et al. 2004). Se han producido y caracterizado varios antígenos recombinantes. Uno de tales antígenos recombinantes designado como rFh8, que se presenta en gusanos adultos ESA y se describe y caracteriza aquí como una proteína de unión a calcio (Castro, 2001; Silva et al. 2004), es el objeto del trabajo actual.

La hipersensibilidad inmediata tipo 1 se caracteriza por la aparición de altos niveles de anticuerpos IgE después de la presentación del alérgeno. Los aspectos clínicos de la fasciólisis incluyen síntomas alergénicos, alto número de eosinófilos y altos niveles de IgE específico.

La utilización de pruebas de piel para el diagnóstico de infecciones parasíticas se describe mediante muchos autores utilizando extractos crudos de gusano como el antígeno. Se utiliza hipersensibilidad inmediata tipo I como una herramienta de diagnóstico para la fasciólisis humana. El método consiste en una inyección intradérmica de un extracto de gusano crudo. Las principales ventajas de las pruebas de piel son la posibilidad de ser utilizadas en el campo, de ejecución simple y

que la obtención de resultados es rápida. Resumen de la invención: Un antígeno Fh8 como se describe en la Figura 2 para uso en un método de diagnóstico

practicado en el cuerpo de animal o de humano, en donde el método es para reconocer un anfitrión definitivo infectado por o expuesto previamente a F. hepatica que involucra una aplicación en la piel o intradérmica de una cantidad efectiva del antígeno Fh8 y después de un periodo necesario obtener una respuesta de hipersensibilidad inmediata como una pápula de piel con relevancia para propósitos de diagnóstico por su tamaño y elasticidad de la piel.

Breve descripción de las Figuras:

Figura 1: Caracterización del fragmento de cADN que contiene la secuencia que corresponde al polinucleótido Fh8. La secuencia de nucleótido y la secuencia de aminoácidos se deduce para Fh8. Los codones inicial y terminal de la secuencia de aminoácidos están en negro. Los números a la izquierda corresponden a la secuencia de nucleótido y los números a la derecha corresponden a residuos de aminoácidos.

Figura 2: La secuencia de proteína Fh8 (fasciolin) y algunas moléculas mutantes dirigidas al sitio (Fh8ser; Fh8ala; Fh8tyr).

Figura 3: Resultados de la prueba ELISA utilizando suero de ratones Balb/c infectados experimentalmente con 3 Fasciola hepatica metacercariae. Negativo: valores O.D. Medios ± desviación estándar obtenida con suero recolectado de 6 ratones saludables y no infectados. Positivo: valores O.D. Medios ± desviación estándar obtenida con suero recolectado de 6 ratones infectados experimentalmente. O.D. Densidad Óptica.

Figura 4: Purificación de Fh8 del gusano adulto con antígenos Fasciola hepatica excretados/secretados (ESA). A -Cromatografía en columna Sephadex A25-DEAE de antígenos ESA precipitada por sulfato de amonio. La presencia de la proteína se cuantifica por el espectrofotómetro 280 nm y el Fh8 que contiene las fracciones se detecta mediante prueba ELISA utilizando un antisuero específico (ELISA). B -Cromatografía en un Sephacryl S200 HR de Fh8 que contiene fracciones. Las fracciones se analizan como se describió previamente.

Figura 5: Reacciones de la piel (pápulas) observadas en la oveja 2 (A) y 4 (B) (Tabla 1). Hemos procedido a inyección en la piel (intradérmica) de 200 µl de amortiguador (N) y 200 µl de amortiguador más 50 µg de Fh8 (P) in en el área interna de las patas de 2 ovejas infectadas experimentalmente. Las fotos muestran la evolución de la pápula a (T=0), inmediatamente después de inyección, y (T=1,5), una hora y media después de inyección, y también los medios utilizados para medir la pápula. Caracterización de Fh8 (fasciolina) Este antígeno se purifica previamente y se caracteriza por los autores incluidos en la lista de

inventores (Castro, 2001; Silva et al., 2004). La fasciolina (Fh8) es un polipéptido con 69 aminoácidos y un peso molecular de 8 kDa (número Genebank AF213970).

La principal característica de Fh8 es la existencia de 2 motivos putativos de unión de calcio (EF-mano). Los resultados previos muestran que el Fh8 está presente en los productos secretados y excretados del gusano adulo. También se preparan varios mutantes dirigidos a sitio. Estas moléculas modificadas son similares a Fh8 pero presentan diferente estabilidad y actividad biológica y puede ser una alternativa excelente para el Fh8.

Para propósitos de investigación la secuencia codificante Fh8 se subclona en el vector de expresión Escherichia coli pQE (Qiagen). La producción del antígeno recombinante, rFh8, que expresa una etiqueta histidina N-terminal se desarrolla en E. coli M15(pREP4) (Qiagen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Castro, 2001; Silva et al. 2004). La producción y aislamiento del antígeno no es relevante para las reivindicaciones desde otros sistemas de expresión y aislamiento de antígenos recombinantes así como también se puede utilizar el Fh8 nativo aislado de ESA. El sistema descrito de expresión y aislamiento se debe relacionar como un vehículo utilizado para los propósitos de investigación para obtener grandes cantidades de Fh8 utilizado en demostraciones experimentales, in vivo y in vitro.

El Fh8 tiene diagnóstico de interés en la serología de fasciólosis y presenta características alergénicas.

Los estudios se desarrollan (Castro, 2001; Silva et al. 2004) con conejos infectados experimentalmente (con 30 o 100 F. hepatica metacercariae) que muestran la presencia de inmunoglobulina G específica (IgG) contra Fh8 del día 21 en adelante. Hemos detectado IgG contra Fh8 en suero de ovejas infectadas experimentalmente (desde la semana 5 en adelante) y ganado...

1. Un antígeno Fh8 como se describe en la Figura 2 para uso en un método de diagnóstico practicado en el cuerpo de animal o de humano, en donde el método es para reconocer un anfitrión definitivo infectado por o expuesto previamente a F. hepatica que involucra una aplicación en la piel o intradérmica de una cantidad efectiva del antígeno Fh8 y después de un periodo necesario obtener una respuesta de hipersensibilidad inmediata como una pápula de piel con relevancia para propósitos de diagnóstico por su tamaño y elasticidad de la piel.