Un método que comprende las etapas de: (i) la provisión de un polímero activado electrofílicamente,

POLI-L0, 1-E, en el cual: POLI es un segmento polimérico soluble en agua, L es un adaptador opcional, E es un electrófilo, y (ii) la reacción de dicho POLI-L0, 1-E con un reactivo disulfuro simétrico, (NU-Y-S-)2, en el cual: NU es un nucleófilo, Y es seleccionado del grupo que consta de alquileno, alquileno sustituido, cicloalquileno, cicloalquileno sustituido, arilo y arilo sustituido, conteniendo de 2 aproximadamente a 10 áto- mos de carbono aproximadamente, y S es un átomo de azufre, bajo condiciones eficaces para promover la reacción entre E y NU para formar así POLI-L0, 1-X-Y-S-S-Y-X-L0, 1- POLI((POLI-L0, 1-X-Y-S-)2), donde X es un grupo resultante de la reacción entre E y NU

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a un método para preparar derivados tiol-selectivos de un polímero 5 soluble en agua tal como polietilén glicol.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Debido a los avances recientes en biotecnología, proteínas terapéuticas y otras biomoléculas, por ejemplo anticuerpos y fragmentos de anticuerpos, pueden ser preparadas actualmente a gran escala haciendo que tales biomoléculas estén disponibles más fácilmente. Desgraciadamente, la utilidad clínica de biomoléculas terapéuticas potenciales está a menudo impedida por su rápida degradación proteolítica, su inestabilidad tras la producción, el almacenamiento o la administración o por su inmunogenicidad. Debido al interés continuo en la administración de proteínas y otras biomoléculas para uso terapéutico, se han explorado varios procedimientos para superar estas deficiencias.

20 Uno de tales procedimientos que ha sido ampliamente explorado es la modificación de proteínas y otras biomoléculas potencialmente terapéuticas mediante la unión covalente de un polímero soluble en agua tal como polietilén glicol o "PEG" (Abuchowski, A. y col., J. Biol. Chem., 252 (11), 3579 (1977); Davis, S. y col., Clin. Exp. Immunol., 46, 649-652 (1981)). Se ha demostrado que las propiedades biológicas de las proteínas modificadas con PEG, referidas también como conjugados de PEG o proteínas pegiladas, están en muchos casos considerablemente mejoradas respecto a las de sus equivalentes no pegilados (Herman y col., Macromol. Chem. Phys., 195, 203-209 (1994)). Se ha demostrado que las proteínas modificadas con polietilén glicol poseen tiempos mayores en la circulación del organismo debido a una resistencia incrementada a la degradación proteolítica y que poseen también una termoestabilidad incrementada (Abuchowski, A. y col., J. Biol. Chem., 252, 3582-3586 (1977)). Un incremento similar de la bioeficacia se ha observado con otras biomoléculas, por ejemplo anticuerpos y fragmentos de anticuerpos (Chapman, A., Adv. Drug Del. Rev., 54, 531-545 (2002)).

Típicamente, la unión de polietilén glicol a un fármaco o a otra superficie se lleva a cabo utilizando un derivado de PEG activado, es decir, un PEG que tiene al menos un extremo activado adecuado para reaccionar con un centro nucleofílico de una biomolécula (por ejemplo, lisina, cisteína y residuos similares de las proteínas). Los métodos utilizados más habitualmente están basados en la reacción de un PEG activado con los grupos amino de las proteínas, tales como los presentes en las cadenas laterales de lisina de las proteínas. Polietilén glicoles con grupos terminales activados adecuados para la reacción con los grupos amino de las proteínas incluyen PEGaldehídos (Harris, J.M., Herati, R.S., Polym. Prep. (Am. Chem. Soc., Div. Polym. Chem.), 32(1), 154-155 (1991), anhídridos mixtos, ésteres de N-hidroxisuccinimida, carbonilimidazólidos y clorocianuratos (Herman, S., y col., Macromol. Chem. Phys., 195, 203-209 (1994)). Aunque se ha demostrado que muchas proteínas retienen su actividad durante la modificación con PEG, en algunos casos la unión de polímeros a través de los grupos amino de la proteína puede ser indeseable, tal como cuando la derivatización de residuos de lisina específicos inactiva la proteína (Suzuki, T. y col., Biochimica at Biophysica Acta, 788, 248-255 (1984)). Por tanto, sería ventajoso disponer de métodos adicionales para la modificación de una proteína con PEG utilizando otro aminoácido diana para la unión, tal como cisteína. La unión a los grupos tiol de la cisteína de la proteína puede ofrecer una ventaja en cuanto a que las cisteínas son típicamente menos abundantes en las proteínas que las lisinas, reduciendo así la probabilidad de la desactivación de la proteína tras la conjugación a estos aminoácidos que contienen tiol.

Derivados de polietilén glicol que tienen un grupo terminal reactivo tiol-selectivo incluyen maleimidas, vinil sulfonas, yodoacetamidas, tioles y disulfuros. Estos derivados han sido utilizados todos ellos para el acoplamiento a las cadenas laterales de cisteína de las proteínas (Zalipsky, S., Bioconjug. Chem., 6, 150-165 (1995); Greenwald, R.B. y col., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst., 17, 101-161 (2000); Herman, S. y col., Macromol. Chem. Phys., 195, 203-209 (1994)). Sin embargo, muchos de estos reactivos no han sido explotados extensamente debido a la dificultad de su síntesis y purificación. Por ejemplo, el método de Woghiren y col. (Woghiren, C. y col., Bioconjugate Chem., 4, 314-318 (1993)) requiere una serie de etapas sintéticas de transformación y purificación para formar un reactivo PEG-tiol protegido particular. En primer lugar, metoxi-PEG se hace reaccionar con cloruro de tosilo seguido por la purificación del producto de reacción para recuperar el tosil-PEG correspondiente. El tosil-PEG es posteriormente convertido en el PEG-tioacetato correspondiente mediante la reacción con una sal tioacetato, seguido por otra etapa de purificación. Posteriormente se lleva a cabo una alcoholisis con metanol del PEG-tioacetato, seguido por cromatografía en columna para dar lugar a la sal tiolato purificada, que es posteriormente reducida con ditiotreitol para formar el PEG-tiol correspondiente. El PEG-tiol resultante es posteriormente purificado mediante cromatografía en columna. A continuación se prepara una forma protegida del tiol mediante la reacción del PEG-tiol con disulfuro de 4,4'-dipiridilo, seguido por purificación mediante cromatografía en columna. En suma, la metodología de Woghiren para transformar PEG en su forma tiolprotegida requiere cinco etapas de reacción diferentes y cinco etapas separadas adicionales de purificación, haciendo que este procedimiento sintético y otros procedimientos similares sean indeseables y extremadamente largos.

Otra deficiencia significativa de muchas de las vías existentes para producir derivados de PEG mono-funcionales tiol específicos, es la incapacidad, a pesar de las múltiples etapas de purificación, de eliminar el PEG difuncionalizado que se produce a partir del diol que está presente en la materia prima de PEG monofuncional.

Por tanto, existe la necesidad de un método para preparar PEG-tioles activados de alta pureza y otros derivados de PEG tiol-selectivos que sea rápido y sencillo, esto es que requiera un número mínimo de etapas de reacción y purificación, a la vez que mantenga la integridad del segmento de PEG (esto es, que sea llevado a cabo bajo condiciones de reacción suaves), y que pueda proporcionar además derivados de PEG tiol-selectivos de alta pureza con un rendimiento elevado. Tal método ha sido desarrollado por los solicitantes y será descrito con mayor detalle a continuación.RESUMEN DE LA INVENCIÓN

En un aspecto, la presente invención proporciona un método para preparar un derivado tiol-selectivo de un polímero soluble en agua (esto es, un polímero que tenga al menos un extremo que sea un grupo tiol-selectivo, es decir, un grupo que reaccione preferencialmente con tioles tales como un tiol, un tiolato o un tiol protegido). Más particularmente, el método incluye las etapas de (i) la provisión de un polímero soluble en agua que contenga un segmento polimérico soluble en agua denominado en la presente "POLI", con un extremo activado por un electrófilo (-E), denominado generalmente en la presente "POLI-E", seguido por (ii) la reacción de tal polímero con una molécula reactiva que contenga un nucleófilo (-NU) y un resto tiol-selectivo bajo condiciones eficaces para estimular la reacción entre el electrófilo y el nucleófilo con el fin de formar un polímero soluble en agua que tenga un extremo tiol-selectivo, denominado en la presente "POLI-S", donde "S" en esta utilización indica un resto tiol-selectivo. Los restos tiol-selectivos que pueden estar contenidos en la molécula reactiva incluyen tiol, tiol protegido, disulfuro, maleimida, vinil sulfona, yodoacetamida y disulfuro de ortopiridilo.

En una realización particular de la invención, el resto tiol-selectivo es seleccionado del grupo que consta de tiol, tiol protegido y disulfuro.

En los casos en los que el resto tiol-selectivo contenido en la molécula reactiva es un enlace disulfuro, el método puede comprender adicionalmente la etapa de reducción del enlace disulfuro de POLI-S para formar un polímero soluble en agua con un grupo tiol terminal (denominado en la presente "POLI-SH").

En una realización de la invención, por ejemplo cuando el polímero proporcionado en la etapa (i) es un polímero lineal con extremos protegidos...

1. Un método que comprende las etapas de:

(i) la provisión de un polímero activado electrofílicamente, POLI-L0, 1-E, en el cual: POLI es un segmento polimérico soluble en agua, L es un adaptador opcional, E es un electrófilo, y

(ii) la reacción de dicho POLI-L0, 1-E con un reactivo disulfuro simétrico, (NU-Y-S-)2, en el cual: NU es un nucleófilo, Y es seleccionado del grupo que consta de alquileno, alquileno sustituido, cicloalquileno, cicloalquileno sustituido, arilo y arilo sustituido, conteniendo de 2 aproximadamente a 10 átomos de carbono aproximadamente, y

S es un átomo de azufre, bajo condiciones eficaces para promover la reacción entre E y NU para formar así POLI-L0, 1-X-Y-S-S-Y-X-L0, 1POLI((POLI-L0, 1-X-Y-S-)2), donde X es un grupo resultante

20 de la reacción entre E y NU.

2. El método de la reivindicación 1, que comprende además la etapa (iii) de reducción del enlace disulfuro de (POLI-L0, 1-X-Y-S-)2 para formar POLI-L0, 1-XY-SH.

25 3. El método de la reivindicación 1, en el que L1 es un adaptador seleccionado del grupo que consta de alquilo C1-C10 y alquilo C1-C10 sustituido.

4. El método de la reivindicación 3, en el que L1 es un adaptador seleccionado del grupo que consta 30 de (CH2)1,2,3,4y5.

5. El método de la reivindicación 1, en el que E es un ácido carboxílico o un derivado de ácido carboxílico activado.

6. El método de la reivindicación 1, en el 35 que E es seleccionado del grupo que consta de ácido carboxílico, éster de ácido carboxílico activado, haluro de ácido y anhídrido activo.

7. El método de la reivindicación 6, en el que E es un N-hidroxisuccinimidil éster.

8. El método de la reivindicación 1, en el que NU es seleccionado del grupo que consta de amino, hidroxi, imino y tiol.

9. El método de la reivindicación 1, en el que NU es -NH2.

10. El método de la reivindicación 1, en el que X es seleccionado del grupo que consta de amida, carbamato, éster carbonato, éter y tioéster.

11. El método de la reivindicación 1, en el que POLI es un óxido de polialquileno.

12. El método de la reivindicación 11, en el que POLI es un polietilén glicol que tiene la estructura H3CQ-(CH1CH2O)nCH2CH2-donde n varía de 10 a 4.000 aproximadamente.

13. El método de la reivindicación 11, en el que POLI está protegido ("capped") terminalmente.

14. El método de la reivindicación 12, en el que L está ausente (L0) o es -CH2-, y E es N-hidroxisuccinimidil éster o 1-hidroxibenzotriazolil carbonato.

15. El método de la reivindicación 14, en el que dicho reactivo disulfuro simétrico es cistamina, donde NU es un amino primario e Y es -(CH2)2-.

16. Un método para preparar un conjugado polímero-proteína, comprendiendo dicho método las etapas de:

(i) la provisión de un polímero activado

electrofílicamente, POLI-L0, 1-E, en el cual: POLI es un segmento polimérico soluble en agua, L es un adaptador opcional, E es un electrófilo,

(ii) la reacción de dicho POLI-L0, 1-E con un reactivo

disulfuro simétrico, (NU-Y-S-)2, en el cual: NU es un nucleófilo, Y es seleccionado del grupo que consta de alquilo C2-C10, alquilo C2-C10 sustituido, arilo y arilo

5 sustituido, y

S es un átomo de azufre, bajo condiciones eficaces para promover la reacción entre E y NU para formar así POLI-L0, 1-X-Y-S-S-Y-XL0, 1-POLI((POLI-L0, 1-X-Y-S-)2), donde X es un grupo

10 resultante de la reacción entre E y NU,

(iii) la reducción del enlace disulfuro de (POLIL0, 1-X-Y-S-)2 para formar POLI-L0, 1-X-Y-SH y

(iv) la reacción de POLI-L0, 1-X-Y-SH con un grupo tiol o con grupo tiol protegido de una proteína para 15 formar un conjugado de la proteína, POLI-L0, 1-X-Y-SS-proteína.

17. El método de la reivindicación 16, en el que dicha proteína es una proteína terapéutica.