DERIVADOS DE PHL P 5A CON ALERGENICIDAD REDUCIDA Y REACTIVIDAD FRENTE A CÉLULAS T MANTENIDA.

Derivados de Phl p 5a con alergenicidad reducida y reactividad frente a células T mantenida La presente invención trata de la preparación y uso de variantes del alérgeno principal Phl p 5a a partir del polen de hierba timotea (Phleum pratense), las cuales, en comparación con los alérgenos conocidos de tipo salvaje, presentan una reactividad IgE reducida y mantienen en gran parte una reactividad con linfocitos T, caracterizadas porque en comparación con los alérgenos de tipo salvaje les falta un segmento que corresponde al segmento de la secuencia de aminoácidos 94 113 de PhI p 5a o los segmentos que corresponden a los segmentos de la secuencia de aminoácidos 94 113 y 175 198 de PhI p 5a. Estas variantes de alérgenos hipoalergénicas pueden utilizarse para inmunoterapia específica (hiposensibilización) de pacientes con alergia al polen de gramíneas o para inmunoterapia preventiva de alergias al polen de gramíneas. Antecedentes de la invención ES 2 367 633 T3 Las alergias del tipo 1 tienen importancia en todo el mundo. Hasta un 20% de la población de los países industrializados sufre de dolencias como rinitis alérgica, conjuntivitis o asma bronquial. Estas alergias son provocadas por alérgenos presentes en el aire (aeroalérgenos), que son liberados por fuentes de diferente procedencia, como polen de plantas, ácaros, gatos o perros. Hasta el 40% de estos alérgicos de tipo 1 muestran además reactividad IgE específica con alérgenos del polen de gramíneas (Freidhoff y col., 1986, J. Allergy Clin. Immunol. 78,1190-2002). Las sustancias desencadenantes de las alergias de tipo 1 son proteínas, glicoproteínas o polipéptidos. En personas sensibilizadas, tras la absorción en las mucosas estos alérgenos reaccionan con los anticuerpos IgE que están unidos a la superficie de los mastocitos. Cuando dos moléculas de IgE se enlazan a través de un alérgeno se produce la liberación de mediadores (p. ej., histamina, prostaglandinas) y citoquinas mediante las células efectoras y con ello se desencadenan los correspondientes síntomas clínicos. Dependiendo de la frecuencia relativa con la que las moléculas de alérgeno individuales reaccionan con los anticuerpos IgE de los alérgicos, se diferencia entre alérgenos mayores y menores. En el caso de la hierba timotea (Phleum pratense) hasta el momento se han identificado como alérgenos principales Phl p 1 (Petersen y col., 1993, J. Allergy Clin. Immunol. 92: 789-796), Phl p 5 (Mat-thiesen y Löwenstein, 1991, Clin. Exp. Allergy 21: 297-307; Petersen y col., 1992, Int. Arch. Allergy Immunol. 98: 105-109), Phl p 6 (Petersen y col., 1995, Int. Arch. Allergy Immunol. 108, 49-54). Phl p 2/3 (Dolecek y col., 1993, FEBS 335 (3), 299-304), Phl p 4 (Haavik y col., 1985, Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 78: 260-268; Valenta y col., 1992, Int. Arch. Allergy Immunol. 97: 287-294, Fischer y col., 1996, J. Allergy Clin. Immunol. 98:189-198) y Phl p 13 (Suck y col., 2000, Clin. Exp. Allergy 30: 324-332; Suck y col., 2000, Clin. Exp. Allergy 30: 1395-1402). Los alérgenos principales dominantes de la hierba timotea (Phleum pratense) son Phl p 1 y Phl p 5, donde Phl p 5 se presenta en dos formas diferentes en cuanto a su masa molecular 5a y 5b, que están codificadas por genes independientes. Las secuencias de aminoácidos deducidas tanto para Phl p 5a como para Phl p 5b se pudieron determinar mediante la técnica del ADN recombinante. Phl p 5a es una proteína de aprox. 32 kDa y reacciona con los anticuerpos IgE del 85 - 90% de los alérgicos al polen de gramíneas. Phl p 5a existe en una serie de variantes homólogas que se diferencian entre sí mediante mutaciones puntuales y probablemente corresponden a diferentes formas alélicas. El polen de las especies de gramíneas empleadas como p.ej. Lolium perenne, Poa pratensis, entre otros, contienen alérgenos que son homólogos a Phl p 5a y se designan conjuntamente como alérgenos del grupo 5. La elevada homología estructural de estos alérgenos del grupo 5 del tipo gramínea condiciona una correspondiente reactividad cruzada elevada de las moléculas con los anticuerpos IgE de los alérgicos al polen de gramíneas. La inmunoterapia específica o hiposensibilización representa una aproximación clásica al tratamiento terapéutico eficaz de las alergias (Fiebig, 1995, Allergo J. 4 (6): 336-339, Bousquet y col., 1998, J. Allergy Clin. Immunol. 102(4): 558-562). Así, se inyectan de forma subcutánea a los pacientes extractos de alérgenos naturales en dosis crecientes. No obstante, con este método existe el peligro de reacciones alérgicas o incluso de un choque anafiláctico. Para minimizar estos riesgos se emplean preparados innovadores en forma de alergoides. Se trata de extractos de alérgenos modificados químicamente que presentan una reactividad IgE claramente reducida, aunque presentan idéntica reactividad frente a células T en comparación con el extracto no tratado (Fiebig, 1995, Allergo J. 4 (7): 377-382). Sería posible una optimización más amplia de la terapia con alérgenos preparados de forma recombinante. Cócteles definidos, dado el caso basados en el patrón de sensibilización individual del paciente, de alérgenos recombinantes 2 de elevada pureza podrían reemplazar a los extractos de fuentes de alérgenos naturales, ya que éstos, aparte de los diferentes alérgenos, contienen una gran cantidad de proteínas acompañantes inmunogénicas pero no alergénicas. Perspectivas realistas, que podrían conducir a una hiposensibilización segura con productos de expresión recombinantes, ofrecen alérgenos recombinantes mutados dirigidos en los cuales se han eliminado de forma 5 específica epítopos IgE, sin perjudicar a los epítopos de células T esenciales para la terapia (Schramm y col., 1999, J. Immunol. 162: 2406-2414). Otra posibilidad para influenciar terapéuticamente sobre el equilibrio alterado de células T auxiliares en los alérgicos es el tratamiento con ADN capaz de expresarse que codifica para los alérgenos relevantes (vacunación con ADN inmunoterapéutico). Las primeras pruebas experimentales de la influencia alergenoespecífica de la respuesta 10 inmune mediante una vacuna de ADN de este tipo se obtuvieron en roedores mediante la inyección de ADN codificante de alérgeno (Hsu y col., 1996, Nature Medicine 2 (5): 540-544). Así pues, el objetivo en que se basa la presente invención consistió en la preparación de nuevas variantes de alérgenos del grupo 5 PhI p 5a a nivel de proteína y ADN, que se caracterizan por una actividad IgE reducida con un mantenimiento amplio de la reactividad frente a células T y por eso son adecuados para la inmunoterapia específica, 15 así como para la vacunación inmunoterapéutica con ADN. Figuras Figura 1: Alineación de fragmentos relevantes de secuencias de ADNc homólogas a Phl p 5a de la especie Pooideae: Lolium perenne (Lol p), Poa pratensis (Poa p) Triticum aestivum (Tri a) y Hordeum vulgare (Hor v) Numeración: posiciones de los nucleótidos de las entradas de ADN Secuencias de Phl p 5a, Poa p 5 y Lol p 5: secuencias de ADNc de la base de datos Gen-Bank del centro National Center for Biotechnology Information (NCBI), Bethesda, EE.UU. Secuencias Hor v y Tri a: secuencias EST de la base de datos EST del instituto Institute for Genomic Research (TIGR),Rockville,EE.UU. Marco continuo: identidad de la secuencia para Phl p 5a (referido a GenBank AJ555152) 25 Marco de puntos: deleción correspondiente a los aminoácidos 94-113 (referido a GenBank AJ555152) Línea discontinua: deleción correspondiente a los aminoácidos 175-198 (referido a GenBank AJ555152) Figura 2: Alineación de secuencias de aminoácidos homólogas a Phl p 5a (fragmentos de secuencia relevantes deducidos a partir de secuencias de ADN) de las especies Pooideae: Lolium perenne (Lol p), Poa pratensis (Poa p) Triticum aestivum (Tri a) y Hordeum vulgare (Hor v) 30 Numeración: posiciones de los nucleótidos de las entradas de ADN Secuencias de Phl p 5a, Poa p 5 y Lol p 5: secuencias de ADNc de la base de datos Gen-Bank del centro National Center for Biotechnology Information (NCBI), Bethesda, EE.UU. Secuencias Hor v y Tri a: secuencias EST de la base de datos EST del instituto Institute for Genomic Research (TIGR),Rockville,EE.UU. 35 Marco continuo: identidad de la secuencia para Phl p 5a (referido a GenBank AJ555152) Marco de puntos: deleción correspondiente a los aminoácidos 94-113 (referido a GenBank AJ555152) Marco discontinuo: deleción correspondiente a los aminoácidos 175-198 (referido a GenBank AJ555152) Figura 3: SDS-PAGE de mutantes de deleción puros en forma de proteínas de fusión con histidina 1) Marcador 40 2) rPhl p 5a wt (His) 3) Phl p 5a DM-D94-113 (His) 4) Phl p 5a DM-D94-113, 175-198 (His) 5) Phl p 5a DM-D175-198 (His) ES 2 367 633 T3 3 6) Marcador Figura 4: SDS-PAGE de las proteínas sin fusionar puras Phl p 5a DM-D94-113, 175-198 y rPhl p 5a wt (arriba)... [Seguir leyendo]

1. Variantes del alérgeno Phl p 5a del grupo 5, las cuales, en comparación con los alérgenos conocidos de tipo salvaje, presentan una reactividad IgE reducida y mantienen en gran parte la reactividad con linfocitos T, caracterizadas porque en comparación con los alérgenos de tipo salvaje conocidos les falta un segmento que corresponde al segmento de la secuencia de aminoácidos 94 113 del PhI p 5a o los segmentos que corresponden a los segmentos de la secuencia de aminoácidos 94 113 y 175 198. 2. Variante del alérgeno PhI p 5a según la reivindicación 1 con una secuencia de aminoácidos seleccionada de una de las secuencias según SEC ID Nº 4 y 8. 3. Variantes alergénicas según la reivindicación 1 o 2 caracterizadas porque se obtienen mediante métodos de ingeniería genética recombinantes. 4. Molécula de ADN que codifica para una variante alergénica según una o varias de las reivindicaciones de la 1 a la 3. 5. Molécula de ADN que corresponde a una secuencia de ADN seleccionada de una de las secuencias según SEC ID Nº 3 y 7. 6. Vector de expresión recombinante que contiene una molécula de ADN según la reivindicación 4 o 5 funcionalmente unido a una secuencia de control de expresión. 7. Un organismo huésped no humano, transformado con una molécula de ADN según la reivindicación 4 o 5 o un vector de expresión según la reivindicación 6. 8. Procedimiento para la preparación de una variante alergénica según una o varias de las reivindicaciones de la 1 a la 3 mediante cultivo de un organismo huésped según la reivindicación 7 y obtención de la variante alergénica correspondiente a partir del cultivo. 9. Variante alergénica según una o varias de las reivindicaciones de la 1 a la 3 como medicamento. 10. Preparación farmacéutica que contiene como mínimo una variante alergénica correspondiente a una o varias de las reivindicaciones de la 1 a la 3 y, dado el caso, otros principios activos y/o coadyuvantes para el tratamiento de alergias en cuya activación participan alérgenos del grupo 5 de Pooideae. 11. Uso de como mínimo una variante alergénica según una o varias de las reivindicaciones de la 1 a la 3 para la preparación de un medicamento para el tratamiento de alergias en cuya activación participan alérgenos del grupo 5 de Pooideae. 12. Molécula de ADN según la reivindicación 4 o 5 como medicamento. 13. Vector de expresión recombinante según la reivindicación 6 como medicamento. 14. Preparación farmacéutica que contiene como mínimo una molécula de ADN según la reivindicación 12 o al menos un vector de expresión según la reivindicación 13 y dado el caso, otros principios activos y/o coadyuvantes para la vacunación inmunoterapéutica con ADN de pacientes con alergias en cuya activación están implicados alérgenos del grupo 5 de Pooideae y/o para la prevención de dichas alergias. 15. Preparación farmacéutica según la reivindicación 14 que contiene hidróxido de aluminio, un oligonucleótido inmunoestimulador con CpG o una combinación de ambos como coadyuvantes. 16. Uso de al menos una molécula de ADN según la reivindicación 12 o al menos un vector de expresión según la reivindicación 13 para la preparación de un medicamento para la vacunación inmunoterapéutica con ADN de pacientes con alergias en cuya activación participan alérgenos del grupo 5 de Pooideae y/o para la prevención de dichas alergias. 22 Alineación de fragmentos relevantes de secuencias de ADNc homólogas a Phl p 5a de la especie Pooideae: Lolium perenne (Lol p), Poa pratensis (Poa p) Triticum aestivum (Tri a) y Hordeum vulgare (Hor v) ES 2 367 633 T3 23 Numeración: posiciones de los nucleótidos de las entradas de ADN Secuencias de Phl p 5a, Poa p 5 y Lol p 5: secuencias de ADNc de la base de datos Gen-Bank del centro National Center for Biotechnology Information (NCBI), Bethesda, EE.UU. Secuencias Hor v y Tri a: secuencias EST de la base de datos EST del instituto Institute for Genomic Research (TIGR), Rockville, EE.UU. Marco continuo: identidad de la secuencia para Phl p 5a (referido a GenBank AJ555152) Marco de puntos: deleción correspondiente a los aminoácidos 94-113 (referido a GenBank AJ555152) Línea discontinua: deleción correspondiente a los aminoácidos 175-198 (referido a GenBank AJ555152) Alineación de secuencias de aminoácidos homólogas a Phl p 5a (fragmentos de secuencia relevantes deducidos a partir de secuencias de ADN) de las especies Pooideae: Lolium perenne (Lol p), Poa pratensis (Poa p) Triticum aestivum (Tri a) y Hordeum vulgare (Hor v) ES 2 367 633 T3 24 ES 2 367 633 T3 Numeración: posiciones de los nucleótidos de las entradas de ADN Secuencias de Phl p 5a, Poa p 5 y Lol p 5: secuencias de ADNc de la base de datos Gen-Bank del centro National Center for Biotechnology Information (NCBI), Bethesda, EE.UU. Secuencias Hor v y Tri a: secuencias EST de la base de datos EST del instituto Institute for Genomic Research (TIGR), Rockville, EE.UU. Marco continuo: identidad de la secuencia para Phl p 5a (referido a GenBank AJ555152) Marco de puntos: deleción correspondiente a los aminoácidos 94-113 (referido a GenBank AJ555152) Marco discontinuo: deleción correspondiente a los aminoácidos 175-198 (referido a GenBank AJ555152) ES 2 367 633 T3 SDS-PAGE de mutantes de deleción puros en forma de proteínas de fusión con histidina Marcador Marcador 26 ES 2 367 633 T3 SDS-PAGE de las proteínas sin fusionar puras Phl p 5a DM-D94-113, 175-198 y rPhl p 5a wt (arriba) y ensayo de identidad con anticuerpos Phl p 5 (abajo) El Phl p 5 mAb Apha-1D11 enlaza la región 175-198 (sólo rPhl p 5a wt es positivo) El Phl p 5 mAb Apha-3B2 enlaza un epítopo común de ambas moléculas PhI p 5a (ambas proteínas son positivas) (mAb: anticuerpo monoclonal) 27 Marcador Cromatografía analítica SEC del mutante de deleción Phl p 5a DM-D94-113,175-198 y del tipo salvaje Phl p 5a recombinante (proteína no fusionada pura) ES 2 367 633 T3 28 Columna: Superdex 75 HR10/30 (Amersham Biosciences, Uppsala, Suecia) Eluyente: PBS Flecha: volumen de exclusión ES 2 367 633 T3 Isoelectroenfoque no desnaturalizante del mutante de deleción Phl p 5a DM-D94-113,175-198 y del tipo salvaje Phl p 5a recombinante (proteína no fusionada pura) Marcador IEF 29 Ensayo con tiras reactivas para comprobar la capacidad de enlace IgE de los mutantes de deleción de Phl p 5a (no desnaturalizante) ES 2 367 633 T3 P: sueros de alérgicos al polen de gramíneas clínicamente definidos Prueba de la reactividad IgE reducida de los mutantes de deleción de Phl p 5a mediante un ensayo de inhibición EAST con dos sueros individuales representativos (a y b) y una mezcla de sueros (c) ES 2 367 633 T3 31 concentración de inhibidor [g/ ml] concentración de inhibidor [g/ ml] ES 2 367 633 T3 32 P: sueros de alérgicos al polen de gramíneas clínicamente definidos concentración de inhibidor [g/ ml] % activación de basófilos % activación de basófilos % activación de basófilos ES 2 367 633 T3 Prueba de la hipoalergenicidad del mutante de deleción de Phl p 5a Phl p 5a DM-D94-113, 175-198 mediante un ensayo de activación de basófilos con basófilos de seis alérgicos al polen de gramíneas diferentes (P) concentración de proteínas [pM] 33 concentración de proteínas [pM]