CRIOCONSERVACIÓN DE HEPATOCITOS.

Procedimiento "in vitro" de preparación de hepatocitos para la crioconservación,

que consta de los pasos siguientes: (a) aportar una matriz, 5 (b) aportar los hepatocitos aislados, (c) sembrar los hepatocitos sobre la matriz con una densidad comprendida entre 2 y 4 x103 mm-2 , (d) dejar en reposo la matriz revestida con las células durante un tiempo de 10 a 180 min, de modo que las células puedan adherirse a dicha matriz, (e) eliminar por lavado las células que no se han adherido a la matriz revestida con las células, 10 (f) dejar en reposo la matriz revestida de células durante un tiempo como máximo de 180 min y (g) congelar la matriz revestida de células en un medio de congelación.

Crioconservación de hepatocitos La presente solicitud se refiere al ámbito técnico de la crioconservación y en concreto a un procedimiento para la preparación de células hepáticas para la crioconservación, a un procedimiento de crioconservación de células hepáticas aisladas y a un procedimiento para la fabricación de un cultivo sandwich de células hepáticas crioconservadas aisladas.

Las células hepáticas aisladas del entramado de tejidos, en especial los hepatocitos, se utilizan sobre todo en forma de cultivos celulares primarios para comprobar el efecto fisiológico de los fármacos en desarrollo. Sobre todo los hepatocitos primarios recién preparados a partir de personas constituyen el “patrón oro” para identificar los principios activos en desarrollo en una serie de ensayos “in vitro” o para realizar estudios del metabolismo de los principios activos o de la inducción enzimática. En este contexto es un inconveniente que los hepatocitos humanos recién aislados no estén disponibles de modo regular y permanente. Existe, pues, demanda de un procedimiento que permita almacenar los hepatocitos aislados durante un cierto período de tiempo. Pero conviene preservar tanto como se posible la función fisiológica de las células, es decir, sobre todo su capacidad metabólica o enzimática.

Ya es sabido que los hepatocitos se almacenan crioconservados. Por lo general los hepatocitos se crioconservan en suspensión. Aparte de los hepatocitos, la suspensión contiene un medio de congelación, que está destinado a impedir que las células se deterioren por la congelación y descongelación. Para su almacenaje, la suspensión se congela normalmente a temperaturas inferiores a -80ºC. Para la utilización después del almacenaje, la suspensión celular congelada se descongela y se depositan las células sobre placas de cultivo o recipientes de cultivo. Para realizar el nuevo cultivo de las células descongeladas normalmente se recogen los recipientes de cultivo con un material de matriz, sobre el que pueden pegarse o fijarse las células. Que esta adhesión tenga éxito es esencial para el nuevo cultivo y los análisis posteriores. Por lo general solamente se logra que una pequeña porción de las células originales congeladas se conserve en estado viable y pueda recultivarse. El inconveniente de este procedimiento estriba sobre todo en que no puede preverse si o en qué medida las células descongeladas de la suspensión se podrán fijar sobre la placa de cultivo. La porción de las células pegadas de un lote dependerá del lote individual. Por lo general solamente en un reducido número de los lotes se conseguirá que las células crioconservadas y descongeladas se peguen de modo satisfactorio sobre la placa de cultivo.

Otro procedimiento conocido de crioconservación consiste en depositar las células recién aisladas en recipientes de cultivo para después congelar las células depositadas junto con los recipientes de cultivo. También en este caso, antes de depositar las células se recubren los recipientes de cultivo con una matriz, sobre la que las células podrán fijarse. Como ya es sabido, se emplean con preferencia geles de colágeno. En un procedimiento ya conocido se siembran los hepatocitos sobre placas de cultivo recubiertas con colágeno de tipo I y se deja que durante unas 4 horas se adhieran a la matriz de colágeno. Después se cultiva el cultivo monocapa resultante (cultivo celular monocapa) durante unas 20 horas. A continuación se eliminan por lavado las células que no se hayan adherido. Pasadas 6 horas se inunda el cultivo con medio de congelación, se enfría a -70ºC y se almacena (Watts y Grant, Human & Experimental Toxicology 15, 30-37, 1998) . Para su utilización posterior se descongelan los cultivos monocapa y se recultivan. Pero los cultivos descongelados presentan una porción elevada de células no adheridas y no viables así como escombros celulares. Es cierto que la mayor parte de la matriz está cubierta de células, pero no se consigue un conjunto celular confluyente ni coherente.

En otros procedimientos conocidos se congelan los hepatocitos en una configuración sandwich, es decir, en una configuración de doble gel. Para ello en primer lugar se siembra una suspensión de hepatocitos sobre placas de cultivo celular recubiertas con gel de colágeno. Pasadas 24 horas de cultivo de las células se vierte una segunda capa de gel de colágeno sobre las células sembradas previamente. A continuación se congela la estructura sandwich resultante en el medio de congelación a -70ºC y se almacena (Koebe y col., Cr y obiology 27, 576-584, 1990) .

Con la inmovilización de los hepatocitos en la matriz o entre dos matrices antes de la congelación se estabilizan mecánicamente las células y, de este modo, se aumenta el índice de supervivencia. Debido a que las células en estadio recién aislado de gran vitalidad pueden adherirse o fijarse, el grado de fijación es mucho mayor que la fijación de las células congeladas en suspensión y descongeladas después de haberse crioconservado. A pesar de ello, también en este caso después de la descongelación aparecen grandes porciones de células no adheridas o bien no viables. El estado ideal, que es un cultivo confluyente de hepatocitos viables, no se consigue. Además se pone de manifiesto que las células congeladas en suspensión por lo general pierden su capacidad metabólica a las pocas horas de haberse descongelado. Por ello son inadecuadas para un gran número de ensayos “in vitro”.

Además, las células aisladas de órganos humanos son por lo general menos robustas que las células extraídas de modelos animales. Esto puede atribuirse ante todo al hecho de que las células humanas se extraen de órganos de donantes por lo general en condiciones que son menos favorables que las existentes en el caso de las células de animales, que por lo general se crían para este fin y en el momento oportuno se eutanasian (por ejemplo ratas, ratones o cerdos) . Por ello, las células humanas exigen condiciones de cultivo mucho más suaves. Hasta el presente no se conoce ningún proceso de crioconservación que permita crioconservar con éxito los hepatocitos humanos, para después poder realizar estudios “in vitro” durante un período de tiempo prolongado.

Existe, pues, demanda de un procedimiento mejorado de crioconservación de hepatocitos, que permita una crioconservación cuidadosa, es decir, que permita realizar una descongelación suave con un alto índice de supervivencia. Un procedimiento de crioconservación mejorado deberá ser apropiado sobre todo para crioconservar con éxito los hepatocitos humanos. Para ello debería garantizar que las células descongeladas puedan recultivarse en buena parte, a ser posible en forma de monocapa confluyente (monocapa coherente) , sobre la matriz de cultivo. El procedimiento deberá además se adecuado para poder preparar mejores cultivos sandwich de hepatocitos aislados, que en buena parte contengan células viables. Deberá asegurarse además que las células recultivadas, descongeladas después de la crioconservación, conserven sus capacidades metabólicas o enzimáticas durante un período de tiempo lo más prolongado posible, de modo que puedan utilizarse para un gran número de ensayos “in vitro”.

El problema técnico que se aborda con la presente invención consiste, pues, en aportar un procedimiento mejorado de crioconservación de células hepáticas aisladas, en especial de hepatocitos humanos, de modo que las células hepáticas crioconservadas puedan recultivarse finalmente en forma de cultivo sandwich mejorado.

El problema técnico abordado se resuelve con un procedimiento según la reivindicación 1, es decir, un procedimiento “in vitro” de preparación de hepatocitos para la crioconservación, que consta de los pasos siguientes:

En el paso (a) se prepara una matriz, en especial una matriz de colágeno, con preferencia un gel de colágeno. La matriz se deposita previamente con preferencia en un recipiente de cultivo celular, por ejemplo una placa de 6 hoyos. El recipiente de cultivo se recubre con preferencia con el material de matriz.

En el paso (b) se aportan las células hepáticas aisladas, en especial aisladas del tejido.

En el siguiente paso (c) se siembran las células hepáticas aisladas sobre la matriz. La densidad de los hepatocitos sobre la matriz se sitúa entre 2 y 4 x 103 células por mm2 de la superficie de la matriz. La densidad celular preferida se sitúa entre 2, 6 y 3, 2 x 103 mm-2. Es decir, en un recipiente de cultivo que tenga una superficie... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento “in vitro” de preparación de hepatocitos para la crioconservación, que consta de los pasos siguientes:

(a) aportar una matriz, 5 (b) aportar los hepatocitos aislados,

(c) sembrar los hepatocitos sobre la matriz con una densidad comprendida entre 2 y 4 x103 mm-2 ,

(d) dejar en reposo la matriz revestida con las células durante un tiempo de 10 a 180 min, de modo que las células puedan adherirse a dicha matriz,

(e) eliminar por lavado las células que no se han adherido a la matriz revestida con las células, 10 (f) dejar en reposo la matriz revestida de células durante un tiempo como máximo de 180 min y

(g) congelar la matriz revestida de células en un medio de congelación.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la matriz es una matriz de colágeno.

3. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, en el que en el paso (d) el reposo dura de 30 a 90 min.

15 4. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, en el que en el paso (e) se recubre o inunda con medio de cultivo y después se succiona el líquido sobrenadante de la matriz revestida de células.

5. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, en el que en el paso (f) el reposo dura de 30 a 180 min.

6. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, en el que en el paso (g) se añade el medio de conge20 lación en una cantidad de 0, 5 µl mm-2 .

7. Procedimiento según la reivindicación 6, en el que el medio de congelación contiene un 10% de suero fetal bovino (FCS) y un 10% de DMSO.

8. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, en el que en el paso (g) la congelación tiene lugar después de inundar o recubrir la matriz revestida de células con el medio de congelación y enfriar de modo controla do hasta -80ºC o menos, con una velocidad de enfriamiento de 0, 5 a 20ºC min-1, eventualmente con compensación de la transición de fases.

9. Procedimiento para el almacenado y recultivo de células hepáticas aisladas, que consta de estos pasos:

de (a) a (g) del procedimiento según una de las reivindicaciones de 1 a 8, (h) almacenar la matriz revestida de células congelada, 30 (i) descongelar la matriz revestida de células congelada,

(j) eliminar por lavado las células no adheridas a la matriz revestida de células,

(k) recubrir la matriz revestida de células descongelada con una segunda matriz y

(l) recultivas las células aprisionadas u ocluidas entre las dos matrices.

10. Procedimiento según la reivindicación 9, en el que en el paso (h) se realiza el almacenado a -150ºC.

11. Procedimiento según la reivindicación 9 ó 10, en el que en el paso (i) se recubre o inunda la matriz revestida de células con un medio de cultivo caliente.

12. Procedimiento según una de las reivindicaciones de 9 a 11, en el que en el paso (j) se recubre la matriz revestida de células con el medio de cultivo y después se succiona el líquido sobrenadante situado sobre la matriz revestida de células.

13. Procedimiento para la preparación de un cultivo sandwich de hepatocitos aislados, que consta de los pasos de (a) a (l) del procedimiento según una de las reivindicaciones de 9 a 12.