Medio de almacenamiento para células.

Procedimiento para el almacenamiento por poco tiempo de células hepáticas,

recogiéndose las células en un medio celular líquido que contiene

a) solución salina

- que contiene cloruro de sodio, gluconato de sodio, acetato de sodio, cloruro de potasio, cloruro de magnesio y citrato de sodio,

b) glucosa y

c) albúmina sérica y/o plasma sanguíneo

y almacenándose en este medio celular.

Medio de almacenamiento para células

La invención se refiere a procedimientos para el almacenamiento de, en particular, células hepáticas humanas, a medios celulares para el almacenamiento de células hepáticas así como al uso de tales medios celulares para el almacenamiento de las células, conservándose la vitalidad de las células durante el almacenamiento.

La crioconservación representa un método usado frecuentemente para el almacenamiento de células vivas a lo largo de periodos de tiempo más prolongados. Las técnicas de crioconservación en el transcurso de la última década se han perfeccionado y mejorado constantemente. Existe una necesidad de almacenar células también por poco tiempo, por ejemplo, directamente después del aislamiento de un órgano, antes de la congelación o después de o durante la descongelación de las células después de la crioconservación. Con frecuencia es necesario que las células después de este almacenamiento se suministren de nuevo directamente a un organismo, en particular a un ser humano. Este suministro de las células se puede realizar, por ejemplo, mediante una administración intravenosa de las células. La administración de células almacenadas, en particular mediante crioconservación, a un ser humano se puede aprovechar, sobre todo, como aplicación clínica, en particular como aplicación terapéutica. De este modo se pueden administrar por vía intravenosa, por ejemplo, trasplantes de células hepáticas humanas para la aplicación terapéutica. Sin embargo, el proceso de congelación y el proceso de descongelación de nuevo y el almacenamiento in vitro anterior o directamente posterior en relación con la vitalidad y el número de células vivas de las células a almacenar continúa representando un problema, en particular en la aplicación clínica.

La presente invención se basa en el problema técnico de facilitar un medio celular fácil de producir y, en la medida de lo posible, económico para el almacenamiento de células hepáticas. Las células preferentemente se han de almacenar, en relación con la crioconservación, antes de la congelación y/o después de la descongelación. Por tanto, la presente invención también se basa en el problema técnico de facilitar un medio celular que permita un almacenamiento por poco tiempo de células animales, preferentemente de células humanas, de forma particularmente preferente de células hepáticas o trasplantes de células hepáticas con una pérdida lo más reducida posible de la vitalidad y del número de células vivas y, por tanto, que represente una alternativa a los medios celulares conocidos.

En relación con la crioconservación son conocidos medios celulares para el almacenamiento y la descongelación de nuevo. Sin embargo, contienen constituyentes tales como del 5 al 2 % de suero fetal bovino (FCS) que para una administración, en particular una administración intravenosa al ser humano, legalmente no están autorizados o incluso son inadecuados.

El documento EP 1 149 9 A1 desvela un procedimiento para el almacenamiento de células hepáticas a bajas temperaturas. Para esto se emplea una solución que contiene lactobionato de sodio, sulfato de magnesio, fosfato de potasio, rafinosa y glutatión. La publicación Marsh D. C. et al. "Hypothermic Preservaron of Hepatocytes, II. Importance of Ca2+ and Amino Acids", Cryobiology, Academic Press Inc. US, 27 (1), febrero 199: 1-8, describe medios de almacenamiento y exigencias mínimas para el almacenamiento hipotérmico de hepatocitos. Un medio de cultivo celular conocido a partir de esto presenta cloruro de sodio, cloruro de potasio, hidrogenofosfato de potasio/sodio, hidrogenocarbonato de sodio y polietilenglicol (PEG) así como una adición de iones de calcio y magnesio así como aminoácidos y sustrato tal como glucosa.

Por tanto, la presente invención se basa además en el problema técnico de poner a disposición un medio que permita, con una reducida pérdida de la vitalidad y del número de células vivas de células hepáticas, una administración sin riesgos de las células a un animal, en particular a un ser humano.

De este modo se puede emplear de forma exitosa Custodiol® como medio celular, por ejemplo, para el almacenamiento en particular de células descongeladas, originalmente crioconservadas, tales como células hepáticas; se desarrolló como solución de conservación para el trasplante de órganos de órganos completos. Sin embargo, Custodiol® no está autorizado legalmente para una administración intravenosa al ser humano. Por tanto, la invención se basa también en el problema técnico de poner a disposición un medio celular para el almacenamiento por poco tiempo de células, en particular en relación con la crioconservación, que esté autorizado para una administración intravenosa en el ser humano y, por tanto, que las células se puedan administrar por vía intravenosa, por ejemplo, después de la descongelación sin etapas de lavado complejas y que reducen el número de células vivas a un ser humano en este medio celular.

La presente invención resuelve el problema técnico en el que se basa esencialmente facilitando un procedimiento para el almacenamiento por poco tiempo de células hepáticas animales o humanas de acuerdo con las reivindicaciones. Se facilita un procedimiento, recogiéndose las células en un medio celular líquido que contiene solución salina, que contiene cloruro de sodio, gluconato de sodio, acetato de sodio, cloruro de potasio, cloruro de magnesio y citrato de sodio, así como glucosa y, además, albúmina sérica y/o plasma sanguíneo, y almacenándose en este medio celular.

En formas de realización preferentes, las células hepáticas son células de mamífero. Se puede tratar, por ejemplo, de células porcinas, bovinas o murinas. De forma particularmente preferente se trata de células humanas. Con células de acuerdo con la invención se quiere decir también suspensiones celulares y trasplantes celulares. Las células pueden ser de un tipo, pero se puede emplear también una composición o co-cultivo de distintos tipos celulares.

De acuerdo con la invención, preferentemente en el caso de las células animales se trata de células para la administración terapéutica. En otra forma de realización preferente, en el caso de las células animales se trata de células para el cultivo in vitro.

En relación con la presente invención, por células hepáticas se entiende una mezcla de células sobre todo compuesta de hepatocitos. Sin embargo, pueden contener también distintas partes de cantidades de linfocitos, células endoteliales y otros grupos celulares no parenquimatosos.

La descongelación y/o el almacenamiento de trombocitos, denominados también plaquetas, queda excluido de la invención. Los trombocitos no son células animales en el sentido de la invención.

En el contexto de la presente invención, por almacenamiento por poco tiempo se entiende un almacenamiento in vitro en un medio de acuerdo con la invención a lo largo de un periodo de tiempo de hasta 24 horas, en particular hasta 1 horas, preferentemente hasta 5 horas, en particular hasta 3 horas.

Por crioconservación se entiende un almacenamiento, la mayoría de las veces a largo plazo, de células por debajo de °C, en particular a de -2 °C a -2 °C. La congelación se realiza, por norma general, a 1 °C/min.

En relación con la presente invención, por un medio celular, denominado también medio, medio de descongelación o medio nutriente, en particular se entiende una solución acuosa líquida. El medio celular sirve para el almacenamiento in vitro de células vivas conservando el mayor número posible de células vivas, es decir, un índice de mortalidad lo más reducido posible de las células, así como una viabilidad o vitalidad lo más elevada posible, conocida por el experto también como viability.

De acuerdo con la invención, preferentemente los constituyentes de un medio celular empleado de acuerdo con la invención están autorizados legalmente para la administración, en particular la administración intravenosa, a un organismo animal, preferentemente a un organismo humano. De acuerdo con la invención, las células después del almacenamiento en un medio de acuerdo con la invención se pueden usar para una aplicación clínica, en particular una administración terapéutica o para ensayos in vitro.

En relación con la presente invención, por una solución salina se entiende una solución acuosa de una o varias sales. La solución salina de acuerdo con la invención contiene cloruro de sodio, gluconato de sodio, acetato de sodio, cloruro de potasio, cloruro de magnesio y citrato de sodio, estando disueltas las sales en agua. El agua empleada es agua estéril, preferentemente... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento para el almacenamiento por poco tiempo de células hepáticas, recogiéndose las células en un medio celular líquido que contiene

a) solución salina

- que contiene cloruro de sodio, gluconato de sodio, acetato de sodio, cloruro de potasio, cloruro de magnesio y cltrato de sodio,

b) glucosa y

c) albúmina sérica y/o plasma sanguíneo y almacenándose en este medio celular.

2. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, siendo las células células crloconservadas y descongelándose y lavándose después de la descongelación en el medio celular, separándose del medio celular y recogiéndose entonces en medio celular reciente para el almacenamiento.

3. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, teniendo el medio celular una temperatura de 2 a 4 °C.

4. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, tratándose en el caso de las células de hepatocitos.

5. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, tratándose en el caso de las células de células de mamífero.

6. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, tratándose en el caso de las células de células humanas.

7. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, tratándose en el caso de las células de células para la administración terapéutica.

8. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 6, tratándose en el caso de las células de células para el cultivo in vitro.

9. Uso de un medio celular como se caracteriza en la reivindicación 1 para el almacenamiento por poco tiempo de células hepáticas, y en particular según el procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 8.

1. Medio celular para el almacenamiento por poco tiempo de células hepáticas, conteniendo el medio celular disueltos en agua

a) cloruro de sodio, gluconato de sodio, acetato de sodio, cloruro de potasio, cloruro de magnesio y citrato de sodio,

b) glucosa y

c) albúmina sérica y/o plasma sanguíneo.

11. Medio celular de acuerdo con la reivindicación 1, siendo la albúmina sérica albúmina sérica humana.

12. Medio celular de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 u 11, siendo el plasma sanguíneo plasma sanguíneo humano.

13. Medio celular de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 12, conteniendo el medio celular del ,45 al ,6 % en peso de cloruro de sodio,

del ,45 al ,55 % en peso de gluconato de sodio,

del ,2 al ,25 % en peso de acetato de sodio,

del ,3 al ,4 % en peso de cloruro de potasio,

del ,25 al ,35 % en peso de cloruro de magnesio hexahidrato

y del ,31 al ,33 % en peso de citrato de sodio.

14. Medio celular de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 13, conteniendo el medio celular del ,1 al ,5 % en peso, preferentemente del ,1 al ,2 % en peso de glucosa.

15. Medio celular de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 14, conteniendo el medio celular del ,5 al 5 % en peso, preferentemente del 3 al 5 % en peso de albúmina sérica.

16. Medio celular de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 15, conteniendo el medio celular del ,5 al 5 % en peso, preferentemente del 3 al 5 % en peso de plasma sanguíneo.

17. Medio celular de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 16, teniendo el medio celular un valor de pH de

6,4 a 8, preferentemente de 7, a 7,4.

18. Medio celular de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 17 que contiene al menos otro constituyente seleccionado de: aminoácidos, hormonas, vitaminas, provitaminas y sustancias de efecto antiapoptótico.

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