Procedimiento para el aislamiento de urea mientras se elimina el CO2 nocivo.

Procedimiento para el aislamiento de urea y eliminación de CO2 de las muestras de plasma que comprende los pasos siguientes

a) Preparar una muestra de plasma

b) Añadir un ácido para eliminar parcialmente el CO2

c) Liofilizar la muestra para eliminar el CO2 y obtener una muestra seca

d) Redisolver la muestra seca y neutralizarla a un pH de 4 hasta 7 con una solución tampón.

Procedimiento para el aislamiento de urea mientras se elimina el CO2 nocivo

La presente invención hace referencia a un método para el aislamiento de urea en muestras de sangre.

La urea es un compuesto orgánico que en el organismo humano equivale a un producto final del metabolismo de los compuestos de nitrógeno. En el hombre la urea es eliminada con la orina.

La formación de urea se lleva a cabo preferentemente en las células del hígado y parcialmente en los riñones. En la formación de urea en el cuerpo aparecen distintas enfermedades que pueden producir daños considerables. La determinación de la formación de urea es un indicador de la función del hígado, por ejemplo, en los trasplantes de hígado o trasplantes de células del hígado.

Tuchman y cois., Pediatric Research 28(64), página 213 describen, por ejemplo, un defecto de la N-acetil glutamato-sintasa y el análisis de la formación de urea.

Para medir la formación de urea los pacientes recibían por vía oral acetato sódico marcado con 13C, que conducía a la formación de urea marcada con 3C; del acetato marcado con 13C se forma 13C2, que se transforma en 13C- fosfato de carbamoilo y a continuación en 13C-urea.

La mayoría de elementos químicos existen en la naturaleza como mezclas de varios isótopos estables o radioactivos. Las frecuencias de los isótopos se indican normalmente incluso en los estudios de trazas con compuestos enriquecidos en la unidad del porcentaje de átomos (% átomos) o bien en ppm. Para describir las variaciones de las frecuencias naturales existe la escala relativa Delta en tanto por mil (°/oo). Los valores ó (por ejemplo, 513C, 51SN, ó18) se definen como la diferencia del correspondiente cociente de isótopos R [(isótopo pesado)/(isótopo ligero)], por ejemplo, R13C=[13C]/[ 12C]) de la muestra frente a un estándar, con respecto a este estándar.

El valor 513C se calcula, por ejemplo, conforme a:

R R

jI3^i _ ^Probe ** Standard 1 _' |

R

'Prob*

R,

`Standard

R

1) 1

Standard

El estándar para el carbono es una cal, PDB (Pee Dee Belemnite). Al incorporar CO2 a la fotosíntesis se empobrece el carbono en 13C. La mayoría de plantas reducen el CO2 en hidratos de carbono por medio de la vía del C3 o de Calvin-Benson. Esto conduce a que la biomasa de C3-plantas- (a estas pertenecen las plantas útiles, arroz, patatas, soja, remolacha y cereales) presente unos valores 513C del orden de -24 hasta -32%o. Otras plantas fijan el CO2 según la vía del 4 o Hatch-Slack. Los valores 513C de los productos de C4-plantas- (maíz, mijo, remolacha) tienen valores 513C del orden de -1 hasta -16%o. Por esta razón los valores ó13C pueden ser utilizados para examinar el origen y la originalidad de las sustancias orgánicas.

La determinación del valor 513C de plasma-urea se lleva a cabo habitualmente mediante una reacción de la urea en C2 con ayuda de un enzima. Por lo tanto es importante que la solución de urea aislada del plasma esté exenta de CO2 extraño. En general el C2 se encuentra en el plasma como C2 libre disuelto o como C2 ligado en forma de bicarbonato. Una liberación completa del plasma de C2 no es fácil; además se debe evitar que en el aislamiento se introduzca CO2 en la muestra.

Para el aislamiento de la urea del plasma sanguíneo Tuchman y cois. Tuchman y cois, emplearon un método con los pasos siguientes:

Una muestra de plasma de ,5 mi se mezclaba con ,5 mi de H2O y 4pl de ácido perclórico del 6% y se separaba la proteína precipitada. A continuación se agitaba el recipiente durante 3 minutos, para permitir la liberación del CO2. Después de trasladar la mezcla a un nuevo recipiente se ajustaba el pH en el intervalo de 6 hasta 7 con 3 pl de KOH 1M y se separaba el perclorato potásico precipitado. Se eliminaba el resto del bicarbonato con ayuda de una columna de intercambio iónico.

La columna se lavaba con 1 mi de HCI 1mM y el eluido se secaba en un recipiente de vidrio a 8°C. La muestra se agitaba durante la noche en un recipiente cerrado, en el cual se colocaba una pieza de gasa empapada con hidróxido sódico para recoger los residuos de CO2..

A continuación se lavaba el recipiente con helio y se tapaba con un tapón de goma impermeable al aire. Se Inyectaban 4 pl de tampón de fosfato potásico ,5M pH 6, con 3 mg de ureasa-enzlma/4 pl a través del tapón de goma. Al cabo de una hora se realizaba una adición de 1 pl de ácido fosfórico 2%, para liberar el CO2 e Interrumpir la reacción de la ureasa. El 13C2 liberado se medía con ayuda de un espectrómetro de masa (IRMS) de relaciones isotópicas.

Las Investigaciones realizadas por la solicitante han demostrado que el método anteriormente descrito es muy sensible. Múltiples fuentes de C2 extraño pueden falsear los valores delta del C2 formado en la urea, medidos en este procedimiento. Es además muy costoso y lento. Debido a la escasa producción de urea se necesita un volumen mayor (,5 mi) de plasma. Esto puede acarrear problemas en los niños. En una validación cruzada con Estados Unidos y Europa no se han observado diferencias comprensibles en los resultados.

Comparando los valores ó13C del C2 producido por la urea se puede constatar que en el método descrito por Tuchmann y cois, para el aislamiento de la urea del plasma, la eliminación del C2 nocivo no se consigue por completo. Los valores ó13C observados por Tuchmann y cois, son muy bajos -25 hasta -26%o.

La urea natural en plasma tiene un valor ó13C de -19 hasta -23%o, dependiendo de la nutrición.

El cometido de la invención consistía en preparar un método que superara algunos de los inconvenientes del método conocido.

El cometido se resuelve mediante un método para aislar urea y eliminar el C2 en las muestras de plasma, que comprenda las etapas siguientes:

a) Preparar una muestra de plasma que contenga urea

b) Añadir un ácido para eliminar parcialmente el C2

c) Liofilizar la muestra para eliminar el C2 y obtener una muestra seca

d) Redisolver la muestra seca y neutralizarla a un pH de 4 hasta 7, preferiblement de 4 hasta 6,9, en particular de 4 hasta 6, con una solución tampón

El punto de partida para el aislamiento de la urea en una muestra de plasma es una muestra de plasma que contenga urea. Las muestras de plasma se pueden obtener de forma conocida a partir de muestras sanguíneas. Debido a la elevada reproducibilidad del método conforme a la invención son suficientes muestras de plasma con un volumen del orden de ,2 hasta ,3 mi, pero también se pueden emplear mayores cantidades.

La muestra de plasma contiene al menos urea con una relación natural de isótopos. Además se puede mezclar con urea enriquecida en 13C. Pero también se puede enriquecer si se le añade acetato o bicarbonato marcados con 13C. Se pueden administrar asimismo sales tolerables, por ejemplo, sales de sodio o potasio.

De acuerdo con la invención se mide la urea haciendo reaccionar la urea con ureasa para la liberación de C2, habiendo eliminado previamente el C2 existente.

En una configuración de la invención se realiza ¡nicialmente una filtración. Para ello se añade disolvente para la precipitación, por ejemplo, acetonitrilo y/o ácido fórmico. Mediante esta filtración se pueden separar proteínas y lípidos del plasma. Para ello son especialmente adecuadas las conocidas columnas hybridSPE1 , que son comercializadas por la empresa SUPELCO. Estas son también especialmente adecuadas para la eliminación de fosfolípidos.

Sin embargo, también se ha demostrado que se puede prescindir de la etapa de separación de proteínas y lípidos del plasma y se pueden obtener valores reproducibles igualmente buenos. La renuncia a la etapa de filtración ahorra tiempo por un lado y también gastos por otro lado.

De acuerdo con la invención se añade un ácido. Mediante la adición de ácidos se separa una parte del C2 de la muestra de plasma. Por ejemplo es apropiada la adición de ácido fosfórico en una concentración de aproximadamente un 2%. Respecto a una muestra de plasma de ,3 mi es suficiente con una cantidad de 5 pl de ácido (por ejemplo, ácido fosfórico). Naturalmente también se pueden emplear otros ácidos.

Una etapa esencial del método conforme a la invención es la correspondiente liofilización de la muestra. La liofilización es un procedimiento en el cual se congela una muestra y se sublima en el vacío el agua contenida en ella. Este método es especialmente adecuado para la eliminación de las cantidades residuales de C2 en la muestra.

A continuación la muestra obtenida se disuelve y se lleva a un pH entre 4 y 7, preferiblemente entre 4 y 6,9, en particular entre 4 y 6,... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento para el aislamiento de urea y eliminación de C2 de las muestras de plasma que comprende los pasos siguientes

a) Preparar una muestra de plasma

b) Añadir un ácido para eliminar parcialmente el C2

c) Liofilizar la muestra para eliminar el C2 y obtener una muestra seca

d) Redisolver la muestra seca y neutralizarla a un pH de 4 hasta 7 con una solución tampón

2. Procedimiento conforme a la reivindicación 1, que se caracteriza por que antes de añadir un ácido al paso b) se realiza una filtración.

3. Procedimiento conforme a la reivindicación 1 ó 2, que se caracteriza por que después del paso d) la muestra es desgasificada a presión reducida.

4. Procedimiento conforme al menos una de las reivindicaciones 1 hasta 3, que se caracteriza por que la muestra en el paso d) se ajusta a un valor de pH de 4 hasta 6, preferiblemente de 5 hasta 6.

5. Procedimiento conforme al menos una de las reivindicaciones 1 hasta 3, que se caracteriza por que la muestra en el paso d) se ajusta a un valor de pH de 4 hasta 6, preferiblemente de 5 hasta 6

6. Procedimiento para la determinación de la relación de isótopos-13C de la urea en una muestra de plasma que comprende los pasos

- Aislamiento de urea mediante un procedimiento conforme a una de las reivindicaciones 1 hasta 5

- Lavado con gas protector

- Adición de ureasa para formar el C2

- Incubación

- Adición de un ácido, para liberar el C2 formado

- Medición de la relación de ¡sótopos-13C del C2 liberado

7. Procedimiento para el diagnóstico del metabolismo de la urea que comprende los pasos de

- Preparar una primera muestra de plasma de un paciente

- Determinar la relación de isótopos-13C de la urea en la primera muestra de plasma conforme a la

reivindicación 6,

- Preparar al menos otra muestra de plasma que proceda del paciente de tal forma que haya sido extraída

del paciente antes de la ingestión del precursor de urea marcado con 13C,

- Determinar la relación de ¡sótopos-13C de la urea en al menos otra muestra de plasma conforme a la

reivindicación 6,

- Cuantificar la cantidad de urea formada mediante la relación de ¡sótopos-13C de la urea en la primera

muestra de plasma y en al menos otra muestra de plasma.

8. Procedimiento conforme a la reivindicación 7, que se caracteriza por que al menos se utilizan otras dos muestras de plasma.

9. Procedimiento conforme a la reivindicación 8, que se caracteriza por que se obtienen otras muestras de plasma en el intervalo de 15 hasta 24 minutos, después de que el paciente haya ingerido el precursor de urea marcado con 13C.

1. Procedimiento conforme a una de las reivindicaciones 8 ó 9, que se caracteriza por que se han obtenido otras muestras de plasma en el intervalo de 15 minutos después de que el paciente haya ingerido el precursor de urea marcado con 13C.