Un procedimiento para la diagnosis de una infección provocada por mycobacterias que comprende las etapas de a) incubar una muestra que comprende células T obtenidas de un ser humano con al menos un antígeno de ensayo de péptido o proteína específico de mycobacterias con la condición de que dicho antígeno de ensayo no sea PPD b) determinar la respuesta inmune mediada por células específica de antígeno de ensayo midiendo el nivel de IP-10 en dicha muestra,

c) comparar el nivel determinado de IP-10 con un nivel de referencia, y d) determinar si es probable que dicho ser humano esté infectado con al menos una mycobacteria, si el nivel de IP-10 determinado es igual a o está por encima del nivel de referencia y/o determinar si es probable que dicho mamífero no esté infectado si dicho nivel de IP-10 determinado está por debajo del nivel de referencia

Campo de la invención

La presente descripción se refiere en general a un ensayo inmunológico y, más particularmente, un ensayo para medir la reactividad inmune mediada por células (CMI). Incluso más particularmente, la presente descripción proporciona un ensayo y un kit para medir la respuesta mediada por células a un antígeno usando sangre entera u otras muestras biológicas adecuadas. El ensayo es útil en protocolos terapéuticos y diagnósticos para aplicaciones humanas, ganaderas y veterinarias y de la fauna salvaje.

La medición de las respuestas inmunes mediadas por células es importante para la diagnosis inmune de muchas enfermedades infecciosas y autoinmune, como un marcador para inmunocompetencia, y para detección de respuestas de células T a antígenos endógenos y exógenos (es decir, infecciones y vacunas).

La presente descripción proporciona un procedimiento para medir la CMI en un mamífero mediante la incubación de una muestra del mamífero que comprende células T u otras células del sistema inmune con un antígeno. Después se detecta la producción de IP-10. La presencia o nivel del efector inmune es después indicativo del nivel de sensibilidad mediada por células del sujeto y permite el diagnóstico de una infección provocada por Mycobacterias.

Antecedentes de la invención

Tuberculosis

El descubrimiento de antígenos específicos de Mycobacterium tuberculosis (MTB) ha conducido a una nueva línea de enfoque significativa para la diagnosis de la tuberculosis (TB). Trabajos anteriores han mostrado el potencial para reemplazar la prueba cutánea de la tuberculina (TST) mediante una prueba que ensaya la producción in vitro de interferón gamma (IFN-γ) mediante células T en respuesta a antígenos de MTB definidos. Aproximadamente al mismo tiempo, un avance principal fue el descubrimiento de los antígenos altamente inmunogénicos de la diana 6 antigénica de secreción precoz (ESAT-6),, proteína 10 de filtrado de cultivo (CFP-10) y TB7.7 que mejoran la especificidad significativamente. Estos antígenos están codificados dentro de región de diferencia 1 (RD1) del patógeno y están por lo tanto ausentes de todas las cepas de vacuna Bacille Calmette Guerin (BCG) y la mayoría de Mycobacterias no tuberculosas (las excepciones incluyen Mycobacterium kansasii, Mycobacterium marinum Mycobacterium szulgai). Las respuestas de IFN-γa la superposición de péptidos de los antígenos ESAT-6, CFP-10, TB7.7 codificados por RD1 forman la base de la detección de la infección por MTB en dos ensayos con licencia y comercialmente disponibles.

QuantiFERON-TB Gold (Cellestis Limited, Carnegie, Victoria, Australia), un inmunoensayo ligado a enzima (ELISA) de sangre entera tiene la aprobación de la calificación de la CE Europea y recientemente recibió la aprobación de la Administración de Alimentos y Fármacos Americana (FDA) para la detección de tanto la infección como enfermedad por TB.

T-SPOT.TB (Oxford Inmunotec, Oxford, Reino Unido), un ensayo de inmunotransferencia ligado a enzima (ELISPOT) que usa células mononucleares de sangre periférica tiene la aprobación de la calificación de la CE Europea y se aprobó para uso en Canadá en 2005. TSPOT. TB solamente usa ESAT-6 y CFP10.

Sin embargo, las limitaciones de los ensayos actualmente disponibles son:

1) La sensibilidad puede estar alterada en individuos inmunosuprimidos (tales como VIH positivos o pacientes que reciben medicación inmunosupresora),

2) En algunas situaciones es necesario un volumen relativamente grande de sangre (3 ml por ensayo de QuantiFERON y 8 ml para el T-SPOT.TB), que puede limitar su uso en bebés y niños gravemente enfermos y anémicos,

3) Los ensayos no discriminan entre infección activa, latente y reciente

4) No se ha demostrado que los ensayos sean capaces de predecir quién pasará de TB reciente o latente a TB activa.

La mayoría de las limitaciones de de los ensayos son debidas a la medición del parámetro de efecto del IFN-γ a niveles muy bajos, cerca del límite incluso del procedimiento más sensible (en el ensayo QuantiFERON bajan hasta 0,35 UI/ml (17,5 pg/ml) y en el TSPOT. TB 5 manchas/campo). La disminución del corte para potenciar la sensibilidad eventualmente dará como resultado una especificidad alterada de los ensayos. Una publicación reciente basada en el ensayo QuantiFERON ha mostrado que el ensayo repetido de personas con resultados de ensayo en el intervalo inferior de IFN-γvaría alrededor del nivel de corte que subraya el riesgo potencial de resultados falso positivos y falso negativos del ensayo QuantiFERON (QFT) (Pai, M. et al).

**(Ver fórmula)**

Para superar la fragilidad evidente de los ensayos, la sensibilidad se puede mejorar mediante el uso de antígenos específicos de M. tuberculosis y esto se ha realizado en la tercera generación de los ensayos QuantiFERON (QFT), el QuantiFERON en tubos de ensayo (QFT-IT) que ahora comprende un antígeno adicional llamado TB7.7(p4) y la sensibilidad potencialmente se mejora, pero todavía depende de las mediciones a muy bajos niveles de IFN-γ.

Este planteamiento ha sido ensayado por otros, es decir, recientemente se ha mostrado que Monokine inducida por IFNγ(MIG/ CXCL9) se expresaba específicamente in vitro después de la estimulación con antígenos específicos de M. tuberculosis (ESAT-6/CFP10) y PPD. Sin embargo la sensibilidad de CXCL9, era mucho menor y más baja que la de IFN-γ. Otro estudio más reducido, basado en la citometría de citoquinas intracelulares en células CD4+ T después de estimulación de ESAT-6, probó si la expresión de IFN-γ, IL-2, IL-4, IL-10 o el marcador de activación CD40L puede distinguir enfermedad de TB de no TB. Ninguno de estos marcadores se encontró que eran comparables o superiores a IFN-γ(Abramo C, et al) (Hughes, A. et al).

Todavía no se han identificado marcadores sensibles y específicos para reemplazar IFN-γpara diagnosis de infección por TB en la bibliografía publicada actualmente. Varios han descrito IP-10 en relación con las infecciones, pero no como un marcador en la diagnosis de infección con una estimulación de antígeno anterior.

Clamydia

La diagnosis de infecciones genitales por Clamydia evolucionaron rápidamente desde los años 1990. Los ensayos de amplificación de ácido nucleico (NAAT), tales como reacción en cadena de la polimerasa (PCR), amplificación basada en la transcripción (TMA), y el ensayo de amplificación con desplazamiento de cadena de DNA (SDA) son ahora los soportes principales. Los NAAT de Clamydia más comúnmente usado y ampliamente estudiado en los Estados Unidos y otros muchos países industrializados son Aptima (Gen-Probe), Probe-Tec (Becton-Dickinson), y Amplicor (Roche). El ensayo Aptima Combo II ensaya simultáneamente para C. trachomatis y Neisseria gonorrhoeae, la causa de gonorrea. NAAT para Clamydia se puede realizar sobre muestras de escobillón recogidas del cuello uterino (mujeres) o uretra (hombres)

Actualmente, los NAAT tienen aprobación reguladora solamente para muestras de ensayo urogenitales. Los NAAT han reemplazado ampliamente el cultivo, el estándar de oro histórico para la diagnosis de Clamydia, y los ensayos de sonda no amplificados, tales como Pace II (Gen-Probe). El ultimo ensayo es relativamente insensible, detectando exitosamente solamente el 60 - 80 % de las infecciones en mujeres asintomáticas, y proporcionando ocasionalmente resultados falso positivos. El cultivo permanece útil en circunstancias seleccionadas y es actualmente el único ensayo aprobado para ensayar muestras no genitales.

De este modo la diagnosis de Clamydia está basada en una la tecnología complicada y que requiere recursos tal como PCR, no disponibles fácilmente en el mundo en vías de desarrollo. Una tecnología rápida y fácil mejoraría las mediciones de diagnóstico para esta enfermedad importante.

El documento CA 2.478.138 describe que los niveles elevados en sangre de la quimioquina CXCL10 están asociados a la insuficiencia respiratoria (por ejemplo SARS, influenza y neumonía adquirida en comunidad) y son útiles en la diagnosis de pacientes. Se proporcionan procedimientos para la diagnosis y tratamiento de pacientes que padecen insuficiente respiratoria.

El documento WO 05/091969 describe marcadores de TSE (Encefalopatías Espongiformes Transmisibles) que están presentes antes de... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para la diagnosis de una infección provocada por mycobacterias que comprende las etapas de

a) incubar una muestra que comprende células T obtenidas de un ser humano con al menos un antígeno de ensayo de péptido o proteína específico de mycobacterias con la condición de que dicho antígeno de ensayo no sea PPD

b) determinar la respuesta inmune mediada por células específica de antígeno de ensayo midiendo el nivel de IP-10 en dicha muestra,

c) comparar el nivel determinado de IP-10 con un nivel de referencia, y

d) determinar si es probable que dicho ser humano esté infectado con al menos una mycobacteria, si el nivel de IP-10 determinado es igual a o está por encima del nivel de referencia y/o determinar si es probable que dicho mamífero no esté infectado si dicho nivel de IP-10 determinado está por debajo del nivel de referencia.

2. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la muestra se divide en al menos dos fracciones y

a) se incuba la primera fracción de la muestra con al menos un antígeno de ensayo de péptido o proteína específico de mycobacterias para generar una muestra de respuesta

b) se incuba la segunda fracción de la muestra con una solución inactiva para generar una muestra nula

c) se determina el nivel de IP-10 en las dos fracciones

d) se determina la respuesta inmune dependiente de antígeno de ensayo mediada por células de la muestra restando el nivel de IP- 10 determinado en la muestra nula de la IP-10 determinada en la muestra de respuesta

e) se compara la respuesta inmune mediada por células dependiente del antígeno de ensayo o un valor derivado de la misma con el nivel de referencia o un valor derivado del mismo, y

f) se determina si es probable que dicho mamífero tenga una infección si dicho nivel de respuesta inmune mediada por células específica de antígeno de ensayo es igual a o está por encima del nivel de referencia y/o se determina si es probable que dicho ser humano no tenga una infección si dicho nivel de respuesta inmune mediada por células específica de antígeno de ensayo determinado está por debajo del nivel de referencia.

3. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 2, que comprende además la división de la muestra en 3 fracciones e incubar la tercera fracción de la muestra con un activador de células T para generar un control positivo.

4. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la infección es una infección activa, una infección latente, una infección reciente y/o una infección latente a largo plazo.

5. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la mycobacteria se selecciona entre el grupo que consta de organismos complejos de M. tuberculosis, mycobacterias donde la región de diferencia (RD1) no se ha suprimido y mycobacterias patógenas para los seres humanos.

6. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el antígeno de ensayo de péptido o proteína específico de mycobacterias se selecciona entre el grupo que consta de antígenos RD-1, ESAT-6, CFP10, TB7.7, Ag 85 y HSP-65.

7. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la muestra se obtiene a partir de sangre.

8. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la muestra es sangre entera.

9. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes que además comprende

a) determinar el nivel de MCP-1 en respuesta a la estimulación específica de antígeno de ensayo,

b) combinar el nivel determinado de IP-10 y MCP-1, y c) comparar dicho nivel combinado con un nivel de referencia combinado.

**(Ver fórmula)**

10. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende además

a) determinar el nivel de INF-γy opcionalmente MCP-1 y/o IL-2 en respuesta a la estimulación específica de 5 antígeno de ensayo,

b) combinar el nivel determinado de IP-10 and INF-γy opcionalmente MCP-1 y/o IL-2, y

c) comparar dicho nivel combinado con un nivel de referencia combinado.

11. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la medición del nivel de IP-10 se determina mediante una técnica inmunológica seleccionada entre el grupo que consta

10 de ELISA, Luminex, Multiplex, inmunotransferencia, ensayos de TRF, ensayos inmunocromatográficos de flujo lateral, técnicas de inmunoensayo enzimático homogéneo (EMIT), ensayo RAST, radioinmunoensayos, inmunofluorescencia, ensayos inmunológicos con tira reactiva seca (Dry Stick), ensayo cromatográfico con tira reactiva (Stick) y ensayo inmunocromatográfico.