Una bacteria Pasteurella atenuada seleccionada entre Mannheimia haemolytica,

Actinobacillus pleuropneumoniae y Haemophilus somnus, comprendiendo la bacteria una mutación en un gen representado por una secuencia polinucleotídica que codifica un polipéptido atpG que comprende una secuencia aminoacídica al menos el 80% idéntica a la SEQ ID NO: 167, en la que la atenuación de la bacteria está causada por la mutación

Composiciones de vacunas antibacterianas.

Campo de la invención

La presente invención se refiere en general a la identificación de genes responsables de la virulencia de bacterias de la familia Pasteurellaceae, permitiendo de este modo la producción de nuevas cepas mutantes atenuadas útiles en vacunas y para la identificación de nuevos agentes antibacterianos que se dirigen a los genes virulentos y a sus productos.

Antecedentes de la invención

La familia Pasteurellaceae abarca varios patógenos importantes que infectan a una amplia variedad de animales. Además de P. multocida, son miembros destacados de la familia Pasteurella (Mannheimia) haemolytica, Actinobacillus pleuropneumoniae y Haemophilus somnus. P. multocida es un cocobacilo inmóvil gramnegativo que se encuentra en la flora normal de muchos animales silvestres y domésticos, y se sabe que es el causante enfermedades en numerosas especies animales en todo el mundo. [Biberstein, En M. Kilian, W. Frederickson y E. L. Biberstein (ed.). Haemophilus, Pasteurella, and Actinobacillus. Academic Press, Londres, pág. 61-73 (1981)]. Entre las manifestaciones de la enfermedad tras la infección se incluyen septicemias, bronconeumonías, rinitis e infecciones de heridas [Revisado en Shewen, y col., En C. L. Gyles y C. O. Thoen (ed.), Pathogenesis of Bacterial Infections in Animals Iowa State University Press, Ames, pág. 216-225 (1993), incorporado en este documento como referencia].

La infección por P. multocida generalmente es el resultado de la invasión durante periodos de estrés, aunque la transmisión también puede producirse por exposición a aerosol o por contacto, o mediante vectores como pulgas y garrapatas. En las aves de corral, la infección por P. multocida da lugar a una septicemia de aguda a muy aguda, especialmente prevalente en pavos de corral y aves acuáticas silvestres en condiciones de estrés asociadas con hacinamiento, puesta, cambio de pluma o variación climatológica extrema. En el ganado, sigue a la infección una septicemia hemorrágica similar y se manifiestan afecciones como fiebre alta y depresión, seguidas generalmente de una muerte rápida. La transmisión es más probable a través del contacto por aerosol, aunque la infección también puede aparecer durante los periodos de variación climatológica significativa. En conejos, la infección se produce con rinitis purulenta recurrente, generalmente seguida de conjuntivitis, otitis media, sinusitis, abscesos subcutáneos y bronconeumonía crónica. En infecciones graves, la mortalidad del conejo se produce por bronconeumonía fibrinosa aguda, septicemia y endotoxemia. Los estados patológicos surgen normalmente durante periodos de estrés. En cerdos, los estados patológicos de P. multocida normales incluyen rinitis atrófica y neumonía bacteriana. Se han detectado también afecciones de neumonía similares en perros, gatos, cabras y ovejas. P. multocida se detecta normalmente en la flora bucal de muchos animales y es, por tanto, un contaminante frecuente en heridas por mordeduras y arañazos.

Las cepas de P. multocida normalmente se designan por el serogrupo capsular y el serotipo somático. Se distinguen cinco serogrupos capsulares (A, B, D, E y F) y 16 serotipos somáticos por la expresión de antígenos termoestables característicos. La mayoría de las cepas son específicas del hospedador y raramente infectan a más de uno o dos animales. La existencia de serotipos diferentes representa un problema para la vacunación debido a que la célula bacteriana completa muerta tradicional normalmente proporciona sólo protección específica de serotipo. Sin embargo, se ha demostrado que la infección natural con un serotipo puede producir una protección inmunológica frente a serotipos múltiples [Shewen, y col., En C. L. Gyles y C. O. Thoen (Ed.), Pathogenesis of Bacterial Infections in Animals. Iowa State University Press, Ames, pág. 216-225 (1993)] y la protección cruzada también puede estimularse usando bacterias inactivadas crecidas in vivo [Rimler, y col., Am J Vet Res. 42:2117-2121 (1981)]. Se ha utilizado como vacuna una cepa mutante espontánea viva de P. multocida y se ha demostrado que estimula una fuerte respuesta inmunitaria [Davis, Poultry Digest, 20:430-434 (1987), Schlink, y col., Avian Dis. 31(1):13-21 (1987)]. Sin embargo, se ha demostrado que esta cepa atenuada revierte a un estado virulento o causa mortalidad si se estresa al receptor de la vacuna [Davis, Poultry Digest. 20:430-434 (1987), Schlink, y col., Avian Dis, 31 (1):13-21 (1987)].

Otro miembro de la familia Pasteurella, A. pleuropneumoniae muestra una especificidad por el hospedador estricta para cerdos y es el agente causal de la pleuroneumonía porcina altamente contagiosa. La infección normalmente surge en condiciones de reproducción intensiva, y se considera que ocurre mediante un modo directo de transmisión. La enfermedad es a menudo mortal y, en consecuencia, produce graves pérdidas económicas para la industria de la cría del cerdo. La infección por A. pleuropneumoniae puede ser crónica o aguda y la infección se caracteriza por una bronconeumonía necrótica hemorrágica acompañada de pleuritis fibrinosa. Hasta la fecha, la virulencia bacteriana se ha atribuido a proteínas estructurales, incluyendo polisacáridos capsulares específicos de serotipo, lipopolisacáridos y proteínas superficiales, así como toxinas citolíticas extracelulares. A pesar de la purificación y, en algunas ocasiones clonación, de estos factores de virulencia, no se conoce bien la función exacta de estos factores de virulencia en una infección de A. pleuropneumoniae.

Se han identificado doce serotipos de A. pleuropneumoniae basándose en las diferencias antigénicas en los polisacáridos capsulares y en la producción de toxinas extracelulares. Los serotipos 1, 5 y 7 son los más importantes para la infección por A. pleuropneumoniae en Estados Unidos, mientras que los serotipos 1, 2, 5, 7 y 9 son predominantes en Europa. Hay al menos tres toxinas extracelulares significativas de A. pleuropneumoniae que son miembros de la familia de hemolisinas y se denominan toxinas RTX. Las toxinas RTX son producidas por muchas bacterias gramnegativas, incluyendo E. coli, Proteus vulgaris y Pasteurella haemolytica y, generalmente, las proteínas comparten características estructurales y funcionales. Sin embargo, las toxinas de los diversos serotipos difieren en la especificidad del hospedador, células diana y actividades biológicas.

Las principales toxinas RTX de A. pleuropneumoniae son ApxI, ApxII y ApxIII. ApxI y ApxII tienen actividad hemolítica, siendo ApxI más potente. ApxIII no muestra actividad hemolítica, pero es citotóxica para macrófagos y neutrófilos alveolares. La mayoría de los serotipos de A. pleuropneumoniae produce dos de estas tres toxinas. Por ejemplo, los serotipos 1, 5, 9 y 11 expresan ApxI y ApxII, y los serotipos 2, 3, 4, 6 y 8 expresan ApxII y ApxIII. Sin embargo, el serotipo 10 produce sólo ApxI y los serotipos 7 y 12 expresan sólo ApxII. Aquellos serotipos de A. pleuropneumoniae que producen tanto ApxI como ApxII son las cepas más virulentas de la bacteria.

Se demostró que las toxinas Apx son factores de virulencia en modelos murinos y de infección en cerdos usando bacterias naturales mutadas aleatoriamente [Tascon, y col., Mol. Microbiol. 14:207-216 (1994)] También se han generado otros mutantes de A. pleuropneumoniae con mutagénesis dirigida para inactivar el gen que codifica la proteína de virulencia de la membrana externa AopA [Mulks y Buysee, Gene 165:61-66 (1995)].

Se ha demostrado la existencia de al menos once serotipos (1, 2, 5-9, 12-14 y 16) en Mannheimia [Pasteurella] haemolytica [Angen, y col., Vet Microbiol 65(4):283-90 (1999)], una especie de Pasteurellaceae que es responsable de epidemias graves de neumonía aguda en corderos, terneros y cabras recién nacidos, de destete, en crecimiento y adultos [Ackermann, y col., Microbes Infect 2(9):1079-88 (2000)]. El transporte, las infecciones víricas, el hacinamiento y otras condiciones estresantes predisponen a los animales a infecciones por M. haemolytica [Ackermann, y col., supra]. Se considera que la leucotoxina (Lkt) de M. haemolytica tiene una función significativa en la patogénesis, causando lisis celular y apoptosis que inducen la patología pulmonar característica de la fiebre del transporte bovina... [Seguir leyendo]

1. Una bacteria Pasteurella atenuada seleccionada entre Mannheimia haemolytica, Actinobacillus pleuropneumoniae y Haemophilus somnus, comprendiendo la bacteria una mutación en un gen representado por una secuencia polinucleotídica que codifica un polipéptido atpG que comprende una secuencia aminoacídica al menos el 80% idéntica a la SEQ ID NO: 167, en la que la atenuación de la bacteria está causada por la mutación.

2. La bacteria de la reivindicación 1, en la que la mutación da lugar a la disminución de la expresión de un producto génico codificado por el gen mutado.

3. La bacteria de la reivindicación 1, en la que la mutación da lugar a la expresión de un producto génico inactivo codificado por el gen.

4. La bacteria de la reivindicación 1, en la que la mutación comprende la deleción de todo o parte del gen.

5. La bacteria de la reivindicación 1, en la que la mutación comprende una inserción en el gen.

6. La bacteria de cualquier reivindicación precedente, en la que la bacteria es Mannheimia haemolytica.

7. Una bacteria Pasteurella atenuada seleccionada entre Mannheimia haemolytica, Actinobacillus pleuropneumoniae y Haemophilus somnus, comprendiendo la bacteria una mutación en una secuencia polinucleotídica que codifica un polipéptido atpG, en la que la secuencia polinucleotídica se hibrida con el complemento de la SEQ ID NO: 166 en condiciones rigurosas, comprendiendo las condiciones un lavado final en tampón que comprende SSCx2/SDS al 0,1%, de 35ºC a 45ºC.

8. La bacteria de la reivindicación 7, en la que la mutación está en la secuencia polinucleotídica de la SEQ ID NO: 166.

9. Una composición inmunógena que comprende la bacteria según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.

10. Una composición de vacuna que comprende la composición inmunógena según la reivindicación 9 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

11. La composición de vacuna según la reivindicación 10 que, además, comprende un adyuvante.

12. Un polinucleótido purificado y aislado que comprende una secuencia nucleotídica que codifica un polipéptido que tiene la SEQ ID NO: 167.

13. El polinucleótido de la reivindicación 12, que comprende la SEQ ID NO: 166.

14. El polinucleótido de la reivindicación 13, que es un ADN.

15. Un vector que comprende el ADN de la reivindicación 14.

16. El vector de la reivindicación 15 que es un vector de expresión, en el que el ADN está unido de forma operativa a una secuencia de ADN de control de la expresión.

17. Una célula hospedadora transformada o transfectada de forma estable con el ADN de la reivindicación 15 de forma que se permita la expresión del polipéptido codificado en la célula hospedadora.

18. Un polipéptido purificado que comprende la SEQ ID NO: 167.