BACTERIAS GRAM POSITIVAS DESPROVISTAS DE ACTIVIDAD DE PROTEASA HTRA Y SUS UTILIZACIONES.

Procedimiento para la producción de una proteína de interés, que comprende el cultivo de una bacteria que expresa dicha proteína de interés y la obtención de dicha proteína de interés exportada por dicha bacteria,

caracterizado por que dicha bacteria es una bacteria gram positiva seleccionada entre Streptococcaceae, Lactobacillaceae, Bacillaceae, de los géneros Staphylococcus y Listeria, y Enterococcaceae, del género Enterococcus, cuya proteasa de superficie HtrA está inactivada por mutación

La invención se refiere a la producción, en bacterias Gram positivas, de proteínas exportadas.

Se designa con la expresión general de: “proteínas exportadas”, a proteínas que son 5 transportadas a través de la membrana citoplasmática. En el caso de las bacterias Gram positivas, este transporte desemboca en la secreción de la proteína al medio, o en su asociación con la superficie celular.

Uno de los principales problemas que se plantea durante la producción de proteínas de interés exportadas por bacterias huésped, reside en la degradación de estas proteínas durante y/o 10 después de su exportación, a nivel de la envuelta o de la superficie de la célula. Esta degradación conlleva a menudo una disminución del rendimiento, y/o una alteración de la estructura y de la actividad de la proteína.

Las enzimas responsables de esta degradación de las proteínas exportadas, son proteasas bacterianas exportadas a su vez a la envuelta; se trata de proteínas llamadas: “constitutivas”, 15 que tienen normalmente entre sus funciones principales un papel de degradación de proteínas exportadas anormales o mal plegadas que se acumulan en el medio o en la envuelta, particularmente en condiciones de estrés, así como un papel de reciclado de las proteínas exportadas.

Las proteínas heterólogas, que son a menudo reconocidas de forma imperfecta por las proteínas chaperonas que intervienen en el plegamiento de las proteínas en la bacteria huésped son 20 particularmente sensibles al ataque de estas proteasas.

La proteasa constitutiva exportada caracterizada con más antigüedad es la serina proteasa HtrA/DegP de E. coli. Se trata de una proteasa de localización periplasmática, que se expresa bajo el control de un promotor inducible a alta temperatura; BECKWITH y STRAUCH (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 1576-1580, 1988) observaron que ésta intervenía en la proteolisis de proteínas de 25 fusión entre proteínas exportadas de E. coli y el informador de la exportación PhoA. Propusieron inactivar esta proteasa en E. coli para limitar la degradación de las proteínas heterólogas exportadas.

De este modo se obtuvieron cepas mutantes de E. coli, en las que el gen que codifica la proteasa HtrA/DegP se había inactivado [BECKWITH y STRAUCH, publicación mencionada anteriormente, y Solicitud PCT W088/05821]; sin embargo se ha constatado que esta inactivación se 30 traduce en una ralentización de la cinética de degradación, pero no es suficiente para suprimirla, debido a la existencia en la envuelta de otras proteasas que degradan a las proteínas exportadas.

En E. coli, se han caracterizado varias proteasas constitutivas de la envuelta, que aseguran funciones similares a las de HtrA/DegP: se trata particularmente de las proteasas HhoA/DegQ y HhoB/DegS, estructuralmente homólogas a HtrA/DegP, y de proteasas de estructura diferente pero 35 funcionalmente comparables (ApeA/proteasa I, OmpT, OmpP, Prc/Tsp, SppA/proteasa IV, PrtIII y SohB).

Estudios concernientes a otras bacterias también permitieron demostrar la existencia en cada especie estudiada, de varias proteasas constitutivas exportadas. Por ejemplo, muchas especies bacterianas poseen varias proteasas de la familia HtrA (PALLEN y WREN, Mol. Microbiol. 19: 209-21), tres homólogos de HtrA se identificaron en B. subtilis (YyxA, YkdA y YvtB/Yirf), Synechocystis (HtrA, HhoA y HhoB), Pseudomonas aueruginosa y Aquifex aeolicus, dos en Haemophilus influenzae 5 (HtoA y HhoB), Campylobacter jejuni, Brucella abortus y Yersinia enterolitica, y cuatro en Mycobacterium tuberculosis. Diversas bacterias Gram positivas también poseen serina proteasas consideradas como emparentadas con la familia HtrA, en base a una homología a nivel del dominio catalítico: EtA, EtB, V8/StsP de S. aureus, GseP de Bacillus licheniformis y Spro de Mycobacterium paratuberculosis (KOONIN et al., Cap 117 en Escherichia coli and Salmonella typhimurium, 2203-17, 10 1997). Finalmente, proteasas exportadas no emparentadas con HtrA, también se han descubierto, por ejemplo en B. subtilis (MARGOT y KARAMATA, Microbiology, 142: 3437- 44, 1996; STEPHENSON y HARWOOD Appl. Environn. Microbiol. 64: 2875-2881, 1998; WU et al. J. Bacteriol. 173: 4952-58, 1991).

Se ha propuesto, por lo tanto, combinar mutaciones que afectan a varias proteasas 15 exportadas, para conseguir una reducción efectiva de la degradación de las proteínas heterólogas exportadas.

Por ejemplo, una cepa de E. coli mutada en los genes degP/htrA, ompT, prt y prc (MEERMAN y GEORGIOU, Bio/technology 12: 1107-10, 1994), y una cepa de B. subtilis deficiente en las seis proteasas extracelulares (WU et al., 1991, publicación mencionada anteriormente), se 20 construyeron con este fin. Sin embargo, la utilización de estas cepas no permite eliminar totalmente la proteolisis de las proteínas exportadas. Por ejemplo, en el caso de la cepa de B. subtilis descrita por WU et al., aunque la actividad de proteasa extracelular residual sea despreciable (<1%), la degradación de las proteínas heterólogas exportadas sigue siendo importante. Para paliar este problema, este mismo equipo aportó modificaciones suplementarias a esta cepa, para hacerla sobreproducir diversas 25 chaperonas (WU et al., J. Bacteriol. 180: 2830-35, 1998). Además, aunque la inactivación del gen de una de estas proteasas constitutivas exportadas no tenga consecuencias notables sobre la bacteria, el cúmulo de las mutaciones puede afectar a la viabilidad de las cepas; MEERMAN y GEORGIOU, (1994, publicación mencionada anteriormente) observan de este modo una disminución de la tasa de crecimiento que puede llegar hasta el 50%. 30

En las bacterias lácticas, solamente algunas proteasas exportadas han sido objeto de estudios; la mejor caracterizada actualmente es la proteasa denominada PrtP (KOK, FEMS Microbiol. Reviews 87: 15-42, que se localiza en la superficie celular, donde está anclada al peptidoglicano. Esta proteasa está presente en muchas bacterias lácticas, particularmente Lactococcus lactis, donde su gen es plasmídico. Ésta participa de la nutrición nitrogenada de las bacterias, degradando las caseínas de la 35 leche. Otras proteasas de superficie se purificaron a partir de dos especies de bacterias lácticas, Lactobacillus delbrueckeii subesp. bulgaricus y Lactobacillus helveticus, pero su función no se ha determinado. (STEFANITSI et al., FEMS Microbiol. Lett. 128: 53-8, 1995; STEFANITSI y GAREL,

Lett. Appl. Microbiol. 24: 180-84, 1997; YAMAMOTO, et al., J. Biochem. 114: 740-45, 1993). Recientemente, un gen inducible por el estrés que codifica una proteína fuertemente homóloga a las proteasas de la familia HtrA se ha descubierto en Lactobacillus helveticus (SMEDS et al., J. Bacteriol. 180: 6148-53, 1998). Se ha observado que este gen era necesario para la supervivencia a temperatura elevada; se construyó una cepa mutante de Lactobacillus helveticus en la que el gen htrA se ha 5 inactivado mediante la inserción de un gen informador (gusA, que codifica -glucuronidasa) bajo el control del promotor htrA. El estudio de la expresión del gen gusA en este mutante permitió demostrar una inducción de la transcripción de este gen en las mismas condiciones que la del gen htrA en las cepas silvestres; por el contrario, no se observó ninguna actividad de -glucuronidasa.

Durante trabajos anteriores que pretenden caracterizar proteínas exportadas de 10 Lactococcus lactis mediante el estudio de proteínas de fusión con el informador de exportación SPNuc (POQUET et al., J. Bacteriol. 180: 1904-12, 1998), el equipo de los inventores observó una importante proteolisis extracelular, aunque los experimentos se habían realizado en una cepa de L. lactis subesp. cremoris desprovista de cualquier plásmido, y por lo tanto en particular del que porta prtP.

Los Inventores decidieron buscar las proteasas extracelulares responsables de esta 15 proteolisis.

De este modo descubrieron, en L. lactis, la existencia de un gen de la familia htrA. Este gen, encontrado en el genoma de la cepa IL1403 de L. lactis subesp. lactis, codifica una proteína de 408 aminoácidos, denominada en lo sucesivo HtrALI cuya secuencia nucleotídica y secuencia de aminoácidos se representan en la figura 1, y figuran en la lista de secuencias en el anexo (SEC ID Nº 20 1). Esta proteína es muy homóloga de HtrA de E. coli, y de diversos otros miembros conocidos de la familia HtrA, como muestra la Tabla I a continuación, que ilustra los porcentajes de identidad y de similitud entre HtrALI y diferentes proteínas de la... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento para la producción de una proteína de interés, que comprende el cultivo de una bacteria que expresa dicha proteína de interés y la obtención de dicha proteína de interés exportada por dicha bacteria, caracterizado por que dicha bacteria es una bacteria gram positiva seleccionada entre Streptococcaceae, Lactobacillaceae, Bacillaceae, de los géneros Staphylococcus y 5 Listeria, y Enterococcaceae, del género Enterococcus, cuya proteasa de superficie HtrA está inactivada por mutación.

2. Procedimiento de acuerdo con la Reivindicación 1, caracterizado por que dicha bacteria gram positiva se selecciona entre el grupo constituido por Lactococcus spp., Lactobacillus spp., y Streptococcus thermophilus. 10

3. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las Reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado por que dicha bacteria gram positiva se selecciona entre el grupo constituido por Lactococcus spp., y está desprovista de actividad de proteasa PrtP.

4. Bacteria gram positiva tal como se define en las Reivindicaciones 1 a 3, caracterizada por que comprende al menos una casete de expresión de un gen de interés, a excepción de una cepa de 15 Lactobacillus helveticus que comprende una sola casete de expresión, constituida por la secuencia que codifica el gen informador gusA insertada en el gen htrA de dicha cepa de Lactobacillus helveticus bajo el control transcripcional del promotor de dicho gen htrA.

5. Utilización de una bacteria tal como se define en una cualquiera de las Reivindicaciones 2 a 3, para la preparación de un producto fermentado. 20

6. Utilización de una bacteria tal como se define en una cualquiera de las Reivindicaciones 2 a 3, para la preparación de un alimento dietético.

7. Utilización de una bacteria tal como se define en una cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 3, para la preparación de un medicamento.

8. Utilización de acuerdo con la Reivindicación 7, caracterizada por que dicho 25 medicamento es una vacuna.