APLICACIONES CON ENTRECRUZAMIENTOS ENTRE CADENAS SELECCIONADAS EN ÁCIDOS NUCLEICOS Y MÉTODOS PARA SU PRODUCCIÓN.

Método para la amplificación seleccionada de ciertas secuencias amplificables de un grupo de secuencias amplificables presentes en un cromosoma que comprende producir un ácido nucleico entrecruzado entre cadenas seleccionadas,

con un método que comprende - hibridizar, como mínimo, una secuencia de cadena sencilla seleccionada con un ácido nucleico de cadena sencilla complementaria o un análogo funcional del mismo, - en el que dicha, como mínimo, una secuencia seleccionada o dicho ácido nucleico complementario o ambos comprenden un agente de entrecruzamiento, y cromosómica, - en el que, como mínimo, una de dichas secuencias seleccionadas es una secuencia repetitiva - en el que dichos entrecruzadores entre cadenas seleccionadas dificultan adicionalmente la hibridación y/o la replicación de dicha secuencia seleccionada para disminuir la cantidad de amplificación de un subgrupo de secuencias amplificables y someter dicho grupo a una reacción de amplificación.

Sector de la invención

La presente invención se refiere al sector del entrecruzamiento de ácidos nucleicos y las utilizaciones de los mismos. De manera más específica, la presente invención se refiere a un método para producir entrecruzamientos seleccionados entre cadenas en ácidos nucleicos y las utilizaciones de los mismos. Un aspecto importante de la presente invención se refiere a la utilización de entrecruzamientos seleccionados entre cadenas para la amplificación selectiva de ciertos ácidos nucleicos en una reacción de amplificación.

Antecedentes de la invención

Se han identificado muchos compuestos diferentes que poseen actividad de entrecruzamiento de ácidos nucleicos. El entrecruzamiento de ácidos nucleicos se utiliza más habitualmente para fines terapéuticos en la intervención con trastornos proliferativos, tal como el cáncer. La mayoría de agentes de entrecruzamiento reticulan ácidos nucleicos de maneras muy específicas y en puntos específicos en los ácidos nucleicos. Sin embargo, la frecuencia de estos puntos específicos en la mayoría de ácidos nucleicos es tan elevada que se disponen de entrecruzamientos de forma eficaz a lo largo de las moléculas de ácido nucleico. Para la utilización de estos compuestos de entrecruzamiento en la intervención de cáncer, esta actividad denominada entrecruzamiento aleatorio aparente no evita cierto efecto terapéutico. Sin embargo, en la situación ideal los entrecruzamientos sólo se aplicarían en el ácido nucleico de las células con las que podría interferir la proliferación. Por ejemplo, mediante la aplicación de los entrecruzamientos sólo a los ácidos nucleicos implicados en la transformación de dicha célula, es decir, los oncogenes o el ARN de dichos oncogenes. Dicha especificidad no era posible con los métodos actuales de entrecruzamiento. La actividad de entrecruzamiento aleatorio aparente de agentes de entrecruzamiento también evita la utilización de estos compuestos en ensayos que requieren un entrecruzamiento más específico. La Patente de Estados Unidos No. 5.589.339 da a conocer métodos para la hibridación por sustracción del ADNc. En estos métodos, el ADNc derivado del ARNm transcrito de una fuente de células diana se somete a una hibridación por sustracción utilizando un ácido nucleico de cadena sencilla de una fuente de células de referencia, de manera que se forman moléculas de doble cadena. A continuación, las cadenas de estas moléculas de doble cadena se entrecruzan químicamente utilizando un agente de entrecruzamiento entre cadenas, aziridinilbenzoquinona, y el ADNc de cadena sencilla no sustraído restante derivado únicamente de la fuente de células diana se utiliza como material de sonda. En un aspecto de la presente invención se da a conocer un método para la producción de entrecruzamientos en regiones seleccionadas de un ácido nucleico En un aspecto, dicho método se puede utilizar para evitar, como mínimo, en parte, que ciertas regiones en un ácido nucleico tomen parte en un proceso, tal como, pero sin limitarse al mismo, un proceso que comprende una hibridación o una amplificación o ambas. En un aspecto, dicho método de producción de entrecruzamientos seleccionados entre cadenas se utiliza en un proceso para producir una sonda privada, como mínimo, en parte de secuencias repetitivas. Dicha sonda es útil para la detección de, por ejemplo, secuencias de ácido nucleico en el pintado de cromosomas en el sector de la citogenética.

La introducción de la hibridación por fluorescencia in situ (FISH) ha cambiado significativamente la citogenética. Lichter y otros, TIG Diciembre 1997, Vol. 13, No. 12, páginas 475-479 describen sondas para el pintado de cromosomas generadas mediante la amplificación de ADN repetitivo. La determinación del cariotipo humano por FISH se aplica actualmente de manera satisfactoria para elucidar la redistribución compleja de cromosomas. El análisis por FISH multicolor de cromosomas no se limita necesariamente a la utilización de pintados de todo los cromosomas. Recientemente, se han generado grupos de sondas que reconocen de manera específica las regiones (sub)teloméricas de un cromosoma concreto y que se aplican en un formato de FISH multicolor para detectar translocaciones crípticas, que aparecen frecuentemente en retrasos mentales.

La tinción selectiva de 24 cromosomas humanos en la actualidad se lleva a cabo a través de combinaciones binarias de sondas que están marcadas con 5 fluoróforos distintos (Schroek y otros, 1996; Speicher y otros, 1996).

Para este marcaje denominado combinatorio (también llamado FISH multiplex), el número de dianas reconocibles (n) que utilizan diferentes fluoróforos (k) tienen n = 2k-1 colores. De este modo, cinco fluoróforos permiten un máximo de 31 colores, suficientes para reconocer 24 cromosomas, pero insuficiente, por ejemplo, para explorar las utilizaciones de sondas específicas de los brazos p y q para la detección de redistribuciones intracromosómicas.

De este modo, el análisis FISH multicolor de cromosomas se beneficiaría directamente de un método para incrementar el número de dianas simultáneamente reconocibles más allá de los 27 descritos hasta ahora (Nederlof y otros, 1992; Dauwerse y otros, 1992; Morrison y Legator, 1997). Se puede conseguir una multiplicidad de FISH más elevada mediante un marcaje en proporción. Esta técnica, mediante la cual una sonda determinada está compuesta de una mezcla de sondas con diferentes marcadores fluorescentes, presenta un gran potencial.

Como ilustración, se puede considerar que el número de colores reconocibles puede componerse con los tres colores primarios azul, verde y rojo. Sin embarco, en la práctica, el marcaje en proporción es considerablemente más complejo que el marcaje combinatorio. El reconocimiento de cromosomas teñidos con sondas marcadas proporcionales no es una decisión de “color sí o no” (como en el enfoque binario), sino que requiere una medición precisa del color.

Características de la invención

La presente invención da a conocer métodos para el entrecruzamiento seleccionado de ácidos nucleicos. Se pueden seleccionar y entrecruzar de manera específica regiones específicas en ácidos nucleicos con un entrecruzamiento “no específico” menor o no detectable en regiones no seleccionadas. El método se utiliza en una aplicación no limitante para la amplificación seleccionada de ciertas secuencias de un grupo de secuencias potencialmente amplificables. El método se utiliza en otra aplicación no limitante para la preparación de una sonda para la detección de ácidos nucleicos, en el que se evita que las secuencias seleccionadas, como mínimo, en parte, participen en una reacción de hibridación. En un aspecto, la presente invención da a conocer un método para la generación de una sonda para la detección de cromosomas o partes de los mismos. En un ejemplo no limitante de dicha sonda, ésta se marca mediante un aspecto de la técnica COBRA de la presente invención.

Descripción detallada de la presente invención

En una realización, la presente invención da a conocer un método para la amplificación seleccionada de ciertas secuencias amplificables de un grupo de secuencias amplificables presentes en un cromosoma que comprende producir un ácido nucleico entrecruzado entre cadenas seleccionadas, con un método que comprende

- hibridizar, como mínimo, una secuencia de cadena sencilla seleccionada con un ácido nucleico de cadena sencilla complementaria o un análogo funcional del mismo,

- en el que dicha, como mínimo, una secuencia seleccionada o dicho ácido nucleico complementario

o ambos comprenden un agente de entrecruzamiento, y

- en el que, como mínimo, una de dichas secuencias seleccionadas es una secuencia repetitiva cromosómica,

- en el que dichos entrecruzadores entre cadenas seleccionadas dificultan adicionalmente la hibridación y/o la replicación de dicha secuencia seleccionada para disminuir la cantidad de amplificación de un subgrupo de secuencias amplificables y someter dicho grupo a una reacción de amplificación.

En una realización preferente de la presente invención, sólo dicho ácido o ácidos nucleicos de cadena sencilla o dicho ácido o ácidos nucleicos complementarios comprenden un agente de entrecruzamiento. Dicho ácido nucleico, preferentemente dicho ácido nucleico complementario, también puede ser un análogo funcional de un ácido nucleico. Uno de dichos análogos comprende ácido nucleico... [Seguir leyendo]

1. Método para la amplificación seleccionada de ciertas secuencias amplificables de un grupo de secuencias amplificables presentes en un cromosoma que comprende producir un ácido nucleico entrecruzado entre cadenas seleccionadas, con un método que comprende

- hibridizar, como mínimo, una secuencia de cadena sencilla seleccionada con un ácido nucleico de cadena sencilla complementaria o un análogo funcional del mismo,

- en el que dicha, como mínimo, una secuencia seleccionada o dicho ácido nucleico complementario

o ambos comprenden un agente de entrecruzamiento, y

- en el que, como mínimo, una de dichas secuencias seleccionadas es una secuencia repetitiva cromosómica,

- en el que dichos entrecruzadores entre cadenas seleccionadas dificultan adicionalmente la hibridación y/o la replicación de dicha secuencia seleccionada para disminuir la cantidad de amplificación de un subgrupo de secuencias amplificables y someter dicho grupo a una reacción de amplificación.

2. Método, según la reivindicación 1, en el que dicho análogo funcional de dicho ácido nucleico de cadena sencilla complementaria comprende un ácido nucleico para péptido.

3. Método, según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en el que el agente de entrecruzamiento comprende un metal de transición, preferiblemente platino.

4. Método, según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que el agente de entrecruzamiento es trans-diclorodiaminoplatino (II).

5. Método, según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que se evita que dicho ácido nucleico de cadena sencilla complementaria participe en dicha amplificación mediante la desactivación de la función de extensión del cebador de dicho ácido nucleico de cadena sencilla complementaria, preferentemente mediante la modificación del grupo hidroxilo en 3'.

6. Conjunto de secuencias amplificables obtenibles mediante el método, según cualquiera de las reivindicaciones 1-5, que comprende, como mínimo, una secuencia repetitiva cromosómica entrecruzada.

7. Sonda para la detección de ácido nucleico que comprende un conjunto de secuencias amplificadas marcadas según la reivindicación 6.

8. Utilización de una sonda, según la reivindicación 7, para la detección de cromosomas o partes de los mismos.

9. Utilización de entrecruzadores entre cadenas seleccionadas para disminuir la cantidad de producto amplificado de ciertas secuencias amplificables que comprenden ácido nucleico repetitivo.

10. Utilización, según la reivindicación 8, para la identificación de una enfermedad mediante la tipificación de, como mínimo, un cromosoma.

11. Kit adecuado para la detección de ácido nucleico que comprende, como mínimo, una sonda según la reivindicación 7.

12. Kit adecuado para la generación de una sonda, según la reivindicación 7 o según cualquiera de las reivindicaciones 13-15, que comprende, como mínimo, un agente de entrecruzamiento unido a un ácido nucleico de cadena sencilla que es complementario a una secuencia repetitiva cromosómica.

13. Sonda, según la reivindicación 7, en la que dicho conjunto de secuencias amplificadas marcadas comprende un grupo de, como mínimo, dos moléculas bioorgánicas marcadas con un grupo de, como mínimo, dos colores generados mediante la combinación de marcaje en proporción y marcaje binario.

14. Sonda, según la reivindicación 13, en la que el número total de colores diferenciables de dicha combinación se puede calcular, como mínimo en el caso en el que se utilizan de manera simultánea dos fluoróforos por diana, según la fórmula I

“I” No. de colores = (n + ((r x n)/(2 x (n - 2)))) x 2m

en la que n es el número de fluoróforos utilizados para el marcaje en proporción, m es el número de fluoróforos utilizados para el marcaje binario de la misma diana y r es el número de proporciones que se resuelven mediante marcaje en proporción, con:

2  n  INFINITO, 0  r  INFINITO, 0  m  INFINITO.

15. Sonda, según la reivindicación 13 o la reivindicación 14, en la que, como mínimo, una de dichas 5 moléculas bioorgánicas comprende ácido nucleico, proteína, carbohidrato y/o lípido.

16. Utilización de, como mínimo, una sonda, según cualquiera de las reivindicaciones 13-15, para la identificación simultánea de secuencias de, como mínimo, un cromosoma o parte del mismo.

17. Utilización, según la reivindicación 16, para la identificación de una enfermedad mediante la tipificación de, como mínimo, un cromosoma.

10 18. Kit para la detección de ácido nucleico que comprende, como mínimo, una sonda, según cualquiera de las reivindicaciones 13-15.