Un anticuerpo monoclonal, o su fragmento de unión al antígeno,

obtenible por la inmunización con la cepa Hay de S. epidermidis con Nº. de depósito ATCC 55133, que se une específicamente al ácido lipoteicoico (ALT) de bacterias Gram positivas y es de un isotipo de IgG, en el que el anticuerpo se une y aumenta la opsonización de serotipos múltiples de Staphylococcus epidermidis, estafilococos coagulasa negativos, Staphylococcus aureus y Streptococcus mutans por células fagocíticas con o sin el complemento comparando con un control apropiado en un ensayo de opsonización in vitro, y en el que el anticuerpo es capaz de prevenir la infección estafilocócica en neonatos

Campo de la invención

Esta invención, dentro del campo de las enfermedades inmunológicas e infecciosas, se refiere a anticuerpos que son específicos para bacterias Gram positivas, en particular a ácidos lipoteicoicos expuestos sobre la superficie de las bacterias. La invención incluye anticuerpos monoclonales y quiméricos, así como sus fragmentos, regiones y derivados. Esta invención también se refiere al epítopo al cual se unen los anticuerpos de la invención así como a las secuencias, fragmentos y regiones de los epítopos. Tanto los anticuerpos como los péptidos que abarcan el epítopo, y sus regiones y fragmentos, se pueden usar para la aplicación diagnóstica, profiláctica y terapéutica.

Antecedentes de la invención

El hombre ha combatido durante mucho tiempo las infecciones bacterianas, y nadie puede dudar de los enormes éxitos obtenidos. Antes del descubrimiento y del desarrollo de los antibióticos, la muerte debida a infecciones bacterianas era, con frecuencia, algo rápido e inevitable. Los procedimientos quirúrgicos y las condiciones sanitarias han mejorado mucho desde los tiempos en los que las amputaciones estaban relacionadas con una tasa de mortalidad del 50 por ciento.

Sin embargo, todavía no se ha ganado la batalla. Indudablemente, una parte significativa del problema es que las bacterias son el producto de casi 3 mil millones de años de selección natural - desde que surgieron como un grupo enormemente diverso de organismos que colonizan casi todas las partes del mundo y sus habitantes. Para comenzar a entender a las bacterias se requiere una clasificación, y las categorías más fundamentales para las bacterias tienen que ver con su respuesta debida a la tinción Gram, dando lugar (en su mayor parte) a bacterias Gram positivas y Gram negativas.

La diferencia en la respuesta a la tinción Gram es como consecuencia de las diferencias en las paredes celulares bacterianas. Las paredes celulares de las bacterias Gram negativas están compuestas de una membrana externa única con dos apilamientos de fosfolípidos-proteínas contrarios, con un fosfolípido ordinario en el apilamiento interior, pero con un lipopolisacárido muy tóxico en el apilamiento externo. Las paredes celulares de las bacterias Gram positivas parecen mucho más simples en comparación, conteniendo dos componentes principales, peptidoglicano y ácidos teicoicos más hidratos de carbono adicionales y proteínas según las especies.

De las bacterias Gram positivas, uno de los géneros más comunes es el de Staphylococcus. Los estafilococos colonizan comúnmente a los seres humanos y a los animales y son una causa importante de morbosidad y mortalidad humana, en particular en los pacientes hospitalizados. Los estafilococos son frecuentes en la piel y las membranas mucosas y, en consecuencia, están idealmente situados para producir tanto infecciones localizadas como sistémicas.

Hay dos grupos principales de estafilococos divididos según la producción de "coagulasa", una enzima que hace que la fibrina coagule y forme un coágulo: la coagulasa negativa y la coagulasa positiva. La especie de estafilococos coagulasa positiva más patógena con frecuencia en los seres humanos es el Staphylococcus aureus. El S. aureus es el estafilococo más virulento y produce enfermedades severas y a menudo fatales tanto en huéspedes normales como en inmunodeficientes. El Staphylococcus epidermidis es la especie de coagulasa negativa más común.

En los últimos años, S. epidermidis se ha vuelto la causa principal de las infecciones nosocomiales en pacientes cuyos tratamientos incluyen la colocación de objetos ajenos, tales como derivaciones del fluido cerebroespinal, válvulas cardíacas, catéteres vasculares, prótesis articulares y otras implantaciones en el cuerpo. Las S. epidermidis y S. aureus son causas comunes de infecciones por heridas postquirúrgicas y S. epidermidis también es una causa común de la peritonitis en pacientes con diálisis peritoneal ambulatoria continua. De manera similar, los pacientes con una inmunidad dañada y los que reciben nutrición parenteral por catéteres venosos centrales tienen un riesgo alto de desarrollar sépsis por S. epidermidis. (C.C. Patrick, J. Pediatr., 116:497 (1990)). Se reconoce ahora que S. epidermidis es una causa común de la sépsis nosocomial neonatal. Las infecciones ocurren con frecuencia en niños prematuros que han recibido nutrición parenteral, que puede ser una fuente directa o indirecta de contaminación.

Las infecciones estafilocócicas son difíciles de tratar por una variedad de motivos. La resistencia a los antibióticos es muy común y se hace cada vez más frecuente. Véase L. Garrett, The Coming Plague, "The Revenge of the Germs or Just Keep Inventing New Drugs" Cap. 13, págs. 411-456, Farrar, Straus y Giroux, Nueva York, Editores (1994). En un estudio, la mayoría de los estafilococos aislados de cultivos de sangre de niños sépticos eran múltiples resistentes a los antibióticos (A. Fleer et al., Pediatr. Infect. Dis. 2:426 (1983)). Un estudio más reciente describe un

S. aureus resistente a la meticilina (J. Romero-Vivas, et al., Clin. Infect. Dis. 21:1417-23 (1995)) y una revisión reciente señala que la aparición de la resistencia antibiótica entre aislados clínicos hace que el tratamiento sea difícil

(J. Lee., Trends in Micro. 4 (4):162-66 (abril de 1996). Las publicaciones recientes en los periódicos habituales también describen incidentes preocupantes respecto a la resistencia antibiótica. Véase el Washington Post "Microbe in Hospital Infections Show Resistance to Antibiotics", el 29 de mayo de 1997: el Washington Times, "Deadly bacteria outwits antibiotics", el 29 de mayo de 1997. Además, la resistencia del huésped frente a las infecciones por estafilococos no se entiende claramente. Se ha propuesto que los anticuerpos opsónicos previenen o tratan a las infecciones de estafilococos. Véase, la patente de EE.UU. Nº. 5,571.511 de G.W. Fischer presentada el 5 de noviembre de 1996. Los objetivos microbianos para estos anticuerpos han sido polisacáridos capsulares o proteínas superficiales. En cuanto a los polisacáridos capsulares, los estudios de inmunización de Fattom et al., J. Clin. Micro. 30 (12):3270-3273 (1992) demostraron que la opsonización estaba relacionada con el anticuerpo anticapsular específico del tipo de S. epidermidis, sugiriendo que S. epidermidis y S. aureas tienen una patogénesis similar y un requerimiento opsónico como otros cocos Gram positivos encapsulados, tal como Streptococcus pneumonia. Como proteínas de superficie, Timmerman, et al., J. Med. Micro. 35:65.71 (1991) identificó una proteína superficial de S. epidermidis que era opsónica para la cepa homóloga usada para la inmunización y para la producción del anticuerpo monoclónico. Aunque fueron identificados otros anticuerpos monoclonales que se unen a cepas de S. epidermidis no homólogas, sólo el anticuerpo monoclónico producido frente a la cepa homóloga era opsónico y la opsonización sólo aumentó frente a la cepa homóloga, pero no frente a cepas heterólogas. En consecuencia, según los estudios de Fattom et al., y Timmerman et al., y otros de este campo (y en contraste con nuestros propios estudios), no se esperaría que un anticuerpo que es ampliamente reactivo contra cepas múltiples de S. epidermidis y S. aureus tuviera alguna actividad opsónica frente a ambas. Esto es particularmente cierto para los anticuerpos que se unen tanto a estafilococos coagulasa positivos como coagulasa negativos.

En consecuencia, en la técnica hace falta proporcionar anticuerpos monoclonales que puedan unirse a estafilococos de ambos tipos de coagulasa y que puedan aumentar la fagocitosis y la eliminación de las bacterias y así aumentar la protección in vivo. También hace falta en la técnica epítopos del sitio al que pueden unirse tales anticuerpos de modo que puedan ser identificados y aislados otros anticuerpos con capacidades similares.

Hay una necesidad relacionada en la técnica de anticuerpos monoclonales de humano/ratón quiméricos humanizados u otros. En los últimos estudios publicados, los pacientes a los que se les administraron anticuerpos monoclonales anti-TNF murinos (factor de necrosis tumoral) desarrollaron respuestas de anticuerpos antimurinas frente al anticuerpo administrado (Exley A.R., et al., Lancet 335:1275-1277 (1990)). Este tipo de respuesta inmune al régimen de tratamiento, comúnmente denominada respuesta HAMA, disminuye la eficacia del tratamiento y puede dar hasta un tratamiento completamente ineficaz. Se ha demostrado que los... [Seguir leyendo]

1. Un anticuerpo monoclonal, o su fragmento de unión al antígeno, obtenible por la inmunización con la cepa Hay de

S. epidermidis con Nº. de depósito ATCC 55133, que se une específicamente al ácido lipoteicoico (ALT) de bacterias Gram positivas y es de un isotipo de IgG, en el que el anticuerpo se une y aumenta la opsonización de serotipos múltiples de Staphylococcus epidermidis, estafilococos coagulasa negativos, Staphylococcus aureus y Streptococcus mutans por células fagocíticas con o sin el complemento comparando con un control apropiado en un ensayo de opsonización in vitro, y en el que el anticuerpo es capaz de prevenir la infección estafilocócica en neonatos.

2. El anticuerpo monoclonal o su fragmento de unión al antígeno de la reivindicación 1 que es un anticuerpo humanizado o su fragmento de unión al antígeno, que comprende una cadena ligera que comprende tres regiones determinantes de complementariedad (CDR) de la secuencia 96-110 de la región variable de la cadena ligera de inmunoglobulina expuesta en SEQ ID NOs 98 100 y 104 y una cadena pesada que comprende tres regiones determinantes de complementariedad (CDR) de la secuencia de la región variable de la cadena pesada de la inmunoglobulina 96-110 expuesta en SEQ ID NO 88, 90 y 94.

3. El anticuerpo monoclonal o su fragmento de unión al antígeno de la reivindicación 1, que comprende la región variable de la cadena pesada expuesta en SEQ ID NO 86 a 95 y la región variable de la cadena ligera expuesta en SEQ ID NO 96 a 105.

4. El anticuerpo monoclonal o su fragmento de unión al antígeno de la reivindicación 1, que comprende una región variable de la cadena ligera mostrada en SEQ ID NO 96 a 105, a condición de que el aminoácido 1 de la cadena ligera sea el ácido aspártico y el aminoácido 106 de la cadena ligera sea lisina.

5. El anticuerpo monoclonal o su fragmento de unión al antígeno de la reivindicación 1, en el que el anticuerpo monoclonal es un anticuerpo quimérico que comprende las secuencias de la región variable de la cadena pesada y ligera de la inmunoglobulina 96-110 expuestas en SEQ ID NO 86 a 105 y una región constante humana.

6. El anticuerpo monoclonal o su fragmento de unión al antígeno de la reivindicación 1, en el que el anticuerpo monoclonal es un anticuerpo humanizado que comprende una cadena pesada y una cadena ligera de un anticuerpo anti-ALT, comprendiendo la cadena ligera:

(i) las regiones determinantes de complementariedad (CDR) de las regiones variables de la secuencia 96110 de la región variable de la cadena ligera de la inmunoglobulina expuesta en SEQ ID NO 98, 100 y 104

(ii) las regiones determinantes de complementariedad (CDR) de las regiones variables de la secuencia de la región variable de la cadena pesada de la inmunoglobulina 96-110 expuesta en SEQ ID NO 88, 90 y 94; y

(iii) una región marco variable de una cadena pesada humana aceptadora de inmunoglobulina.

7. El anticuerpo monoclonal o su fragmento de unión al antígeno de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el anticuerpo es del isotipo de IgGI.

8. El anticuerpo monoclonal o su fragmento de unión al antígeno de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que es un anticuerpo quimérico o su fragmento de unión al antígeno en el que el anticuerpo comprende una región Fc humana.

9. El anticuerpo monoclonal o su fragmento de unión al antígeno de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el anticuerpo es un fragmento Fab, Fab', F(ab')2 o sFv de un anticuerpo.

10. El anticuerpo monoclonal o su fragmento de unión al antígeno de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el anticuerpo se une al serotipo 5, serotipo 8 o tanto al serotipo 5 como al serotipo 8 de Staphylococcus aureus.

11. El anticuerpo monoclonal o su fragmento de unión al antígeno de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el anticuerpo además se une específicamente a ALT de una o varias bacterias Gram positivas seleccionadas del grupo que consiste en Streptococcus mutans, Streptococcus faecalis y Streptococcus pyogenes.

12. El anticuerpo monoclonal o su fragmento de unión al antígeno de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el anticuerpo reduce la inflamación mediada por ALT, la producción de citoquina mediada por ALT o la combinación de estos.

13. El anticuerpo monoclonal o su fragmento de unión al antígeno de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el anticuerpo bloquea la unión de bacterias Gram positivas a células epiteliales humanas.

14. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de las reivindicaciones 1-6 y un vehículo farmacéutico.

15. La composición farmacéutica de la reivindicación 14, que comprende además al menos un anticuerpo adicional.

16. El anticuerpo monoclonal de las reivindicaciones 1-6, en el que el anticuerpo es formulado para su uso como un medicamento.

17. El anticuerpo monoclonal de las reivindicaciones 1-6 para su uso en la prevención de una infección estafilocócica en neonatos.

18. El uso de una dosis eficaz del anticuerpo monoclonal de las reivindicaciones 1-6 en la fabricación de un medicamento para la prevención de una infección estafilocócica en neonatos.

19. Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica el anticuerpo, o su fragmento de unión al antígeno, de las reivindicaciones 1-6.

20. Un vector que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 19.

21. Una célula huésped que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 19 o el vector de la reivindicación 20.