ANTICUERPO MONOCLONAL DE ANTI-TENASCINA HUMANA.

El anticuerpo monoclonal anti-tenascina humana cuyas secuencias de la región variable de la cadena pesada y de la región variable de la cadena ligera son SEC ID N.

º: 1 y SEC ID N.º: 2, respectivamente, y los fragmentos proteolíticos de los mismos que se unen a un epitopo antigénico dentro de la repetición similar a EGF de tenascina humana C

La presente invención se refiere a anticuerpos monoclonales anti–tenascina humana, los procedimientos y materiales para obtenerlos, el uso de dichos anticuerpos para la preparación de medios de diagnóstico y medicamentos para el diagnóstico y el tratamiento, respectivamente, de tumores que expresan tenascina y de los materiales que comprenden dichos anticuerpos adecuados para usar en el campo médico. Antecedentes de la invención La especificidad de la terapia de tumores a menudo es una etapa limitante en determinar el éxito de un tratamiento. De hecho, la aparición de efectos tóxicos y la tolerabilidad reducida de ciertos agentes anticancerígenos limitan su uso y la calidad de vida de los pacientes. La reducción de toxicidad está ligada directamente a la selectividad del tratamiento para las células cancerosas. Los anticuerpos monoclonales representan los medios ideales para el marcaje como objetivo de los tumores de forma específica y, cuando se combinan con el sistema de amplificación de avidita/biotina, constituyen una manera extremadamente potente y selectiva para suministrar restos activos en el sitio tumoral. Tenascina es una de las proteínas de la matriz extracelular y muestra la expresión restringida de sitio durante embriogénesis y se puede encontrar en tejidos adultos durante la curación de heridas y la tumorogénesis, así como en vasos sanguíneos tumorales formados recientemente. La tenascina está ausente en el tejido adulto normal, pero se expresa en el estroma de una gran diversidad de tumores sólidos, tales como gliomas (Burdon, y col., cancer Res. 43: 2796– 2805, 1983), tumores mamarios (Chiquet–Ehrismann, y col, 1986), carcinomas de pulmón (Natali y col., Intl. J. Cancer 54: 56–68, 1989), fibrosarcomas y carcinomas de células escamosas (Ramos D.M y col., Int. J. Cancer 75: 680–687, 1998). La tenascina se encuentra en gliomas, pero no en tejido cerebral normal. Para una discusión sobre tenascina, se puede hacer referencia al documento WO 92/04464, Wistar, y a las referencias relacionadas. De acuerdo con la enseñanza del documento EP 0 496 074, G. Paganelli y col. desarrollaron una estrategia de pre–marcaje como objetivo de tres etapas para el tratamiento sistémico y locorregional de los tumores (Cremonesi M y col., EUR. J. Nucl. MED. 26 (2): 110–120, 1999; Paganelli G. y col., EUR. J. Nucl. MED. 26 (4): 348–357, 1999; Paganelli G., y col. Cáncer Biother. & Radiopharm. 16 (3):227–235, 2001). Otras referencias sobre el procedimiento de pre–marcaje como objetivo de tres etapas son los documentos WO 94/04702 y US 5.578.287. El tratamiento de pre–marcaje como objetivo de tres etapas se basa en administración intravenosa, secuencial de un anticuerpo monoclonal anti–tenascina biotinilado, estreptavidina, y biotina marcada con 90Y con las dos administraciones de búsqueda de avidina y de albúmina biotinilada antes de estreptavidina y de biotina marcada con 90Y, respectivamente, para reducir el fondo no específico. La selectividad del enfoque de pre–marcaje como objetivo de tres etapas de Paganelli depende del uso de un anticuerpo monoclonal anti–tenascina. El marcaje como objetivo de la matriz extracelular, comparado con el marcaje como objetivo de los antígenos de células tumorales, presenta la ventaja de no estar afectado por la modulación antigénica de células tumorales representando así un objetivo ideal para terapia antitumoral. Las dosis y la coordinación temporal de las administraciones del tratamiento de pre–marcaje como objetivo de tres etapas se han fijado para lograr proporción de distribución tumoral/no tumoral óptima. Los datos obtenidos a partir del glioblastoma 48 (GBM) o de los pacientes de astrocitoma anaplásico (AA), incluidos en el estudio de Paganelli, mostraron una carencia sustancial de toxicidad, con la excepción de alguna reacción alérgica a estreptavidina (que se puede superar usando avidina), y mostraron indicación preliminar de eficacia terapéutica. De hecho, 2 meses después del final de tratamiento, el 25% de los pacientes mostraron una reducción en el tamaño tumoral (Respuesta Completa (reducción tumoral >50%) = 6%; Respuesta Parcial (reducción tumoral <50%) = 11%; respuesta Menor (reducción tumoral <25%) = 8%) y el 52% de los pacientes no hubieron progresado, con una proporción de respuesta global de por encima del 77%. En algunos de estos pacientes, cuya esperanza de vida era menos de seis meses, la respuesta persistió durante más de un año (Paganelli y col., 1999). El papel de anticuerpo biotinilado anti–tenascina es localizar en el sitio de tumor y presentar biotinas para mediar la posterior acumulación de avidina y de 90–Y–biotina. Se revelan anticuerpos anti–tenascina, por ejemplo, en los documentos US 5.624.659, Duke University, JP 2219590, Rikagaku, el documento anteriormente mencionado WO 92/04464 y en el documento US 6 335 014 que revela el uso de anticuerpos monoclonales de tenascina anti– humano en procedimientos de tratar y evitar metástasis. Se describe un anticuerpo anti– tenascina en Siri A. y col., Nucl. Acids Res. 19 (3): 525–531, 1991; Balza E y col., FEBS 332: 39–43, 1993 y su uso para los propósitos terapéuticos se revela en los anteriormente mencionados Cremonesi M. y col., Eur. J. Nucl. Med. 26 (2): 110–120, 1999; Paganelli G. y col., Eur. J. Nucl. Med. 26 (4): 348–357, 1999; Paganelli, G y col., Cancer Biother. & Radiopharm. 16 (3): 227–235, 2001. El clon usado para generar el anticuerpo anti–tenascina en la técnica se conoce como BC4. El presente solicitante encontró el clon BC4 inadecuado para el desarrollo industrial y los propósitos reguladores debido a la producción de una cadena ligera adicional, no funcional (lo más probablemente de origen de mieloma parental) cuyo nivel de expresión se incrementó a la presión de cultivo de escalamiento, evitando así la purificación de anticuerpo a gran escala.

Sumario de la invención Se ha encontrado ahora que se puede producir un anticuerpo monoclonal de tenascina anti– humano que soluciona los problemas mencionados anteriormente, a saber se puede producir un anticuerpo monoclonal que carece de la expresión de cadenas ligeras no funcionales. Por lo tanto, este anticuerpo es un objeto de la presente invención, conjuntamente con un procedimiento para obtener dicho anticuerpo, su uso en terapia, en particular para la preparación de un medicamento útil para el tratamiento de enfermedades caracterizado por la expresión de tenascina, tales como tumores. Descripción de la invención La presente invención proporciona un anticuerpo y fragmentos de anticuerpos que pueden contener también marcadores adicionales y agentes de diagnóstico, composiciones que contienen estos anticuerpos y fragmentos de anticuerpos, y las composiciones de diagnóstico y terapéuticas que los contienen, su uso en terapia y diagnósticos y procedimientos de preparar estos anticuerpo y fragmentos de anticuerpo. La presente invención también se refiere a DNA que codifica anticuerpo y fragmentos, vectores que contienen DNA, células huésped que contienen vectores, proteína codificada por DNA que codifica proteína de SEQ ID N.ºs: 1 y 2; DNA que codifica proteína y fragmentos; CDR específicas y proteínas que comprenden o que contienen CDR. De acuerdo con la presente invención, dicho anticuerpo se caracteriza porque las secuencias de la región variable de las cadenas ligera y pesada son SEC ID N.º: 1 y SEC ID N.º: 2, respectivamente. Estas secuencias se muestran en las Figuras 10 y 11. En atención a la brevedad, el anticuerpo preferido de acuerdo con la presente invención será identificado con el nombre ST2146. Mientras que la presente invención se centra en ST2146, como ejemplificación de la presente invención, alguien de habilidad ordinaria en la técnica apreciará que, una vez dada la presente divulgación, se pueden producir fragmentos de anticuerpos de ST 2146 y se pueden usar dentro el alcance de la presente invención. En vista del párrafo anterior, la presente invención por lo tanto proporciona un anticuerpo (en lo sucesivo también llamado ST2146) según se define en la reivindicación 1 o un fragmento de anticuerpo o una quimera de anticuerpos (tal como, por ejemplo, una quimera ratón–humano) o una molécula de inmunoglobulina que une específicamente tenascina. La presente invención proporciona un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo o una quimera de anticuerpo según se definen en la reivindicación 2 o una molécula de inmunoglobulina que comprende al menos una de una CDR de la cadena ligera variable de ST2146 y/o una CDR de la cadena pesada variable de ST2146. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo o quimera...

1. El anticuerpo monoclonal anti–tenascina humana cuyas secuencias de la región variable de la cadena pesada y de la región variable de la cadena ligera son SEC ID N.º: 1 y SEC ID N.º: 2, respectivamente, y los fragmentos proteolíticos de los mismos que se unen a un epitopo antigénico dentro de la repetición similar a EGF de tenascina humana C.

2. Un anticuerpo monoclonal contra tenascina C humana, cuya región variable de la cadena ligera comprende secuencias de aminoácidos de SEC ID N.º: 9, SEC ID N.º: 11 y SEC ID N.º: 13 y la región variable de cadena pesada comprende las secuencias de aminoácidos: SEC ID N.º: 15, SEC ID N.º: 17 y SEC ID N.º: 19, o un fragmento de dicho anticuerpo monoclonal, en el que dicho anticuerpo o fragmento se une a un epitopo antigénico dentro de la repetición similar a EGF de la tenascina C humana.

3. El anticuerpo y los fragmentos del mismo de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2 contienen adicionalmente marcadores adicionales y/o agentes de diagnóstico.

4. Un anticuerpo biotinilado o fragmento del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1–3 que se une a un epitopo antigénico dentro de la repetición similar a EGF de tenascina C humana.

5. La línea celular de hibridoma que produce un anticuerpo monoclonal anti– tenascina humana que se une a un epitopo antigénico dentro de la repetición similar a EGF de tenascina C humana, registrada en el Advanced Biotechnology Center en el 29 de enero de 2002 sometida a las disposiciones del Tratado de Budapest, con el número PD02003.

6. Un anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma de la reivindicación 5.

7. El procedimiento para la preparación del anticuerpo de la reivindicación 1 ó 2, que comprende cultivar el hibridoma de la reivindicación 5 y aislar dicho anticuerpo.

8. Uso del anticuerpo o de fragmentos del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1–3 o el anticuerpo o fragmento biotinilado de la reivindicación 4 para la preparación de medios de diagnóstico para la detección de enfermedades que expresan tenascina.

9. Uso de la reivindicación 8, en el que dicha enfermedad es un tumor.

10. Uso de la reivindicación 9, en el que dicho tumor se selecciona del grupo constituido por gliomas, tumores mamarios, carcinomas de pulmón, fibrosarcomas y carcinomas de células escamosas.

11. Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8–10, en el que dicho medios de diagnóstico se usan en técnicas de formación de imagen in vivo.

12. Uso del anticuerpo o de fragmentos del mismo de cualquiera de las

reivindicaciones 1–3 o el anticuerpo o fragmento biotinilado de la reivindicación 4 para la preparación de un medicamento para el tratamiento de tumores que expresan tenascina.

13. Uso de la reivindicación 12, en el que dicho tumor está seleccionado del grupo constituido por tumores cerebrales quísticos, gliomas, tumores mamarios, carcinomas de pulmón, fibrosarcomas y carcinomas de células escamosas.

14. Uso de cualquiera de las reivindicaciones 12–13, en el que dicho medicamento está en forma de un kit adecuado para llevar a cabo el procedimiento de pre–marcaje como objetivo de tres etapas.

15. El kit terapéutico compuesto de 5 viales, cuyo primer vial contiene el anticuerpo

o fragmento biotinilado de la reivindicación 4, el segundo vial contiene una avidina, el tercer vial contiene albúmina biotinilada, el cuarto vial contiene una estreptavidina, el quinto vial contiene biotina radiomarcada o derivado de biotina radiomarcado.

16. El kit terapéutico de acuerdo con la reivindicación 15, en el que dichos viales son adecuados para inyección a humanos.

17. DNA que codifica el anticuerpo o los fragmentos del mismo de la reivindicación 1 ó 2.

18. Proteínas que comprenden o que contienen CDR que se unen a un epitopo antigénico dentro de la repetición similar a EGF de tenascina C humana que tiene las secuencias de aminoácidos: SEQ ID N.º: 9, SEC ID N.º: 11 y SEC ID N.º: 13 y las secuencias de aminoácidos: SEQ ID N.º: 15, SEC ID N.º: 17 y SEC ID N.º: 19.

19. Vector que contiene DNA de la reivindicación 17.

20. Células huésped que contienen vectores de la reivindicación 19.

21. Uso de anticuerpo o fragmentos del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1–3 en combinación con un segundo anticuerpo específico de tenascina en un ensayo de sandwich para la producción de un kit diagnóstico para la determinación del nivel de tenascina circulante.

22. Kit diagnóstico que comprende el anticuerpo o los fragmentos de cualquiera de las reivindicaciones 1–3.

23. Un envase que comprende el anticuerpo biotinilado o fragmentos biotinilados del mismo de la reivindicación 4, tampones y reactivos adecuados para usar en un kit terapéutico para un procedimiento de pre–marcaje como objetivo de tres etapas.

24. El recipiente de acuerdo con la reivindicación 23, que contiene compartimentos múltiples.

25. El recipiente de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 23–24, que comprende adicionalmente un anticuerpo específico de tenascina separado dirigido

preferencialmente hacia el fragmento de A–D.

26. El recipiente de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 23–24, que comprende adicionalmente un anticuerpo específico de tumores separado.

27. El anticuerpo de las reivindicaciones 1–3 en combinación con un segundo

5 anticuerpo específico de tenascina en un ensayo in vitro de ELISA en sandwich en condiciones donde dicho segundo anticuerpo se une a un segundo epitopo antigénico de tenascina, siendo dicho ensayo de ELISA in vitro útil para determinar el nivel de tenascina circulante.

28. Composición farmacéutica que comprende el anticuerpo y/o un fragmento del

mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1–3, en mezcla con al menos un excipiente y/o 10 vehículo farmacéuticamente aceptable.