ANTICUERPO HUMANIZADO HACIA EL FACTOR TISULAR HUMANO (TF) Y PROCEDIMIENTO PARA CONSTRUIR EL ANTICUERPO HUMANIZADO.

Un procedimiento de preparación de un anticuerpo humanizado natural que tiene regiones determinantes de la complementariedad (CDRs) derivadas de anticuerpos no humanos y una región estructural (FR) derivada de un anticuerpo humano natural y que tiene una inmunogenicidad reducida,

y dicho método comprende las etapas de: (1) preparar un anticuerpo monoclonal no humano que responde a un antígeno de interés; (2) preparar una diversidad de anticuerpos humanos que tienen una homología elevada con las secuencias de aminoácidos de las FRs de los anticuerpos monoclonales del punto (1) anterior; (3) sustituir las cuatro FRs del anticuerpo monoclonal no humano del punto (1) anterior con las FRs correspondientes del anticuerpo humano del punto (2) anterior para generar un primer anticuerpo humanizado; (4) determinar la capacidad del anticuerpo humanizado generado en el punto (3) anterior para unirse al antígeno o para neutralizar una actividad biológica del antígeno; (5) sustituir una a tres FRs del anticuerpo humanizado generado en el punto (3) anterior con las FRs correspondientes del anticuerpo humano que son diferentes de las usadas en el punto (3) entre los anticuerpos humanos preparados en el punto (2) para generar el segundo anticuerpo humanizado; (6) comparar la capacidad del segundo anticuerpo humanizado generado en el punto (5) anterior y del primer anticuerpo humanizado generado en el punto (3) anterior en función de la capacidad de unirse al antígeno o de neutralizar la actividad biológica del antígeno, por lo que se selecciona un anticuerpo humanizado que tiene una actividad favorable; (7) llevar a cabo las etapas anteriores de los puntos (3) a (6) para el anticuerpo humanizado seleccionado en el punto (6) anterior; y (8) repetir las etapas anteriores de los puntos (3) a (6) hasta que se obtiene un anticuerpo humanizado que tiene una actividad equivalente al anticuerpo monoclonal no humano del punto (1) anterior

Campo Técnico

La presente descripción se refiere a un anticuerpo quimérico humano/de ratón que comprende la región variable (región V) de un anticuerpo monoclonal de ratón hacia el factor tisular humano (TF) y la región constante (región C) de un anticuerpo humano; un anticuerpo humanizado en el que las regiones determinantes de la complementariedad (CDRs) de la región V de la cadena ligera (cadena L) y la región V de la cadena pesada (cadena H) de un anticuerpo monoclonal de ratón hacia TF humano se han injertado en un anticuerpo humano; la cadena L y la cadena H de dicho anticuerpo; y un fragmento de la región V que constituye la cadena L o la cadena H de dicho anticuerpo. La presente descripción se refiere además a un procedimiento para la producción de un anticuerpo humanizado hacia TF humano.

La presente descripción se refiere además al ADN que codifica el anticuerpo anterior, específicamente un fragmento de la región V del mismo, y al ADN que codifica una cadena L o una cadena H que contiene una región V. La presente descripción se refiere además a un vector recombinante que comprende dicho ADN, y a un hospedador transformado con dicho vector.

La presente descripción se refiere además a un procedimiento de preparación de un anticuerpo quimérico y un anticuerpo humanizado hacia TF humano. La presente descripción se refiere además a una composición farmacéutica y a un agente terapéutico para el síndrome de coagulación intravascular diseminada (CID) que comprende como ingrediente activo un anticuerpo humanizado hacia TF humano.

Técnica Antecedente

El factor tisular (TF), un receptor del factor VII de la coagulación expresado en la superficie celular, desempeña un papel indispensable en la activación de los factores IX y X de la coagulación por medio de la formación de un complejo con el factor VII de la coagulación, y se ha definido como un factor iniciador factible de las reacciones de la coagulación sanguínea.

Se sabe que TF se expresa en los fibroblastos, las células musculares lisas, etc., que constituyen el vaso sanguíneo, y que desempeña una función hemostática activando el sistema de la coagulación al lesionarse el vaso sanguíneo.

La CID es una enfermedad en la que la activación del sistema de coagulación en un vaso sanguíneo conduce a la aparición sistémica múltiple de coágulos sanguíneos, principalmente en la microvasculatura. No es infrecuente que la reducción de plaquetas y de factores de coagulación debida a su consumo conduzca a hemorragias, que son el fenómeno opuesto a la coagulación sanguínea. Los microtrombos múltiples pueden provocar una microcirculación deficiente en los órganos principales, que, una vez desarrollada, conduce a una deficiencia funcional irreversible y a un mal pronóstico de la CID, y en este sentido la CID se considera una enfermedad importante.

La incidencia de enfermedades subyacentes estimada a partir de los informes de investigación de 1990 y 1992 del Ministerio de Salud y Bienestar, de la Encuesta y Grupo de Estudio de Trastornos de la Coagulación Sanguínea y Enfermedades Específicas, es: neoplasias malignas hematológicas, alrededor del 30%; tumores sólidos, alrededor del 20%; infecciones, alrededor del 15%; enfermedades del embarazo, alrededor del 10%; enfermedades hepáticas, alrededor del 6%; choques, alrededor del 5%; y enfermedades cardiovasculares, alrededor del 3%. La incidencia de CID se eleva hasta alrededor del 15% en la leucemia y alrededor del 6 al 7% en el linfoma maligno, y alrededor del 3% en los tumores sólidos.

La CID se desarrolla acompañada por diversas enfermedades mencionadas anteriormente, pero su agente causal es el mismo, es decir, el TF. Así, se cree que el mecanismo de inicio de la CID es: la formación y/o la expresión anormalmente elevada de TF en las células cancerosas en la leucemia aguda, el linfoma maligno, y los tumores sólidos; la formación y/o expresión incrementada de TF en los monocitos y/o las células endoteliales en las infecciones (en particular, la septicemia provocada por bacilos gramnegativos); el flujo de TF hacia la sangre desde el tejido hepático necrosado en la hepatitis fulminante; la expresión de TF en la luz del vaso sanguíneo en el aneurisma aórtico, el aneurisma cardiaco, y el hemangioma gigante; y también el flujo TF hacia la sangre en las enfermedades del embarazo (embolismo de liquido amniótico y abruptio placentae) y en procedimientos quirúrgicos, lesiones y quemaduras.

El tratamiento de las enfermedades originales (subyacentes) es de sumo interés, lo que, sin embargo, no es sencillo en términos prácticos.

Como método actual de tratamiento de la CID, se está usando la terapia anticoagulante y la terapia de sustitución. Se usan principalmente preparaciones de heparina (heparina fraccionada, heparina de bajo peso molecular) para la terapia anti-coagulante. También se usan inhibidores de proteasas sintéticos (mesilato de gabexato, mesilato de nafamostat) y plasma concentrado (preparaciones de anti-trombina III, proteína C activada). Como terapia de sustitución, hay concentrados de plaquetas, plasmas recientes congelados (suministro de fibrinógeno), eritrocitos lavados, y similares.

Sin embargo, los agentes terapéuticos actuales no son satisfactorios en cuanto a la eficacia y los efectos secundarios, y en la mayoría de los casos es imposible la desaparición de la CID. Por lo tanto, existe la necesidad del uso de fármacos que tengan efectos terapéuticos elevados y efectos secundarios bajos.

Por otra parte, como otros intentos de tratamiento de la CID se pueden mencionar las preparaciones de trombomodulina, hirudina, y agentes anti-PAF, y el inhibidor de la ruta del factor tisular (TFPI). Los inhibidores selectivos de FXa están atrayendo la atención como agentes anticoagulantes y/o antitrombóticos administrables oralmente. Además, como agente que neutraliza la actividad del TF, el documento WO 88/07543 describe un anticuerpo monoclonal anti-TF humano de ratón, y el documento WO 96/40921 describe un anticuerpo anti-TF humano humanizado.

Se espera que los anticuerpos monoclonales anti-TF humano de ratón constituyan un agente terapéutico seguro y eficaz, ya que no exhiben los síntomas de hemorragia asociados a la eficacia principal en la CID. Sin embargo, los anticuerpos monoclonales de ratón son sumamente inmunógenos (a veces se denomina "antigénicos"), y así el valor terapéutico médico de los anticuerpos de ratón en seres humanos es limitado. Por ejemplo, la vida media de los anticuerpos de ratón en los seres humanos es relativamente corta, y por lo tanto no pueden exhibir completamente su efecto previsto. Además, el anticuerpo humano anti-ratón (HAMA) que se desarrolla en respuesta al anticuerpo de ratón administrado provoca reacciones inmunológicas que son desfavorables y peligrosas para los pacientes. Así, no se pueden administrar repetidamente anticuerpos monoclonales de ratón a seres humanos.

Para resolver estos problemas, se han desarrollado métodos que pretenden reducir la inmunogenicidad de los anticuerpos derivados de animales no humanos, tales como (los anticuerpos monoclonales derivados de) ratones. Uno de ellos es un método para la producción de un anticuerpo quimérico en el que una región variable (región V) del anticuerpo deriva de un anticuerpo monoclonal de ratón, y una región constante (región C) del mismo deriva de un anticuerpo humano adecuado.

Debido a que el anticuerpo quimérico obtenido contiene una región variable de un anticuerpo de ratón original en forma completa, se espera que se una a un antígeno con una afinidad idéntica a la del anticuerpo de ratón original. Además, en el anticuerpo quimérico la proporción de las secuencias de aminoácidos derivadas de animales no humanos está sustancialmente reducida, y por lo tanto se espera que tenga una inmunogenicidad reducida en comparación con el anticuerpo de ratón original. Sin embargo, todavía es posible que surja una respuesta inmunológica hacia la región variable de ratón (LoBuglio, A. F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 4220-4224, 1989).

Se espera que un segundo método para reducir la inmunogenicidad de un anticuerpo de ratón, aunque mucho más complicado, reduzca drásticamente la inmunogenicidad potencial del anticuerpo de ratón. En este método, se injerta la región determinante de la complementariedad (CDR) sola de un anticuerpo de ratón en una región variable humana para producir una región variable humana "remodelada".... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento de preparación de un anticuerpo humanizado natural que tiene regiones determinantes de la complementariedad (CDRs) derivadas de anticuerpos no humanos y una región estructural (FR) derivada de un anticuerpo humano natural y que tiene una inmunogenicidad reducida, y dicho método comprende las etapas de:

(1) preparar un anticuerpo monoclonal no humano que responde a un antígeno de interés;

(2) preparar una diversidad de anticuerpos humanos que tienen una homología elevada con las secuencias de aminoácidos de las FRs de los anticuerpos monoclonales del punto (1) anterior;

(3) sustituir las cuatro FRs del anticuerpo monoclonal no humano del punto (1) anterior con las FRs correspondientes del anticuerpo humano del punto (2) anterior para generar un primer anticuerpo humanizado;

(4) determinar la capacidad del anticuerpo humanizado generado en el punto (3) anterior para unirse al antígeno o para neutralizar una actividad biológica del antígeno;

(5) sustituir una a tres FRs del anticuerpo humanizado generado en el punto (3) anterior con las FRs correspondientes del anticuerpo humano que son diferentes de las usadas en el punto (3) entre los anticuerpos humanos preparados en el punto (2) para generar el segundo anticuerpo humanizado;

(6) comparar la capacidad del segundo anticuerpo humanizado generado en el punto (5) anterior y del primer anticuerpo humanizado generado en el punto (3) anterior en función de la capacidad de unirse al antígeno o de neutralizar la actividad biológica del antígeno, por lo que se selecciona un anticuerpo humanizado que tiene una actividad favorable;

(7) llevar a cabo las etapas anteriores de los puntos (3) a (6) para el anticuerpo humanizado seleccionado en el punto (6) anterior; y

(8) repetir las etapas anteriores de los puntos (3) a (6) hasta que se obtiene un anticuerpo humanizado que tiene una actividad equivalente al anticuerpo monoclonal no humano del punto (1) anterior.

2. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicho antígeno de interés es el factor tisular (TF) humano.

3. Un procedimiento para la producción de un anticuerpo humanizado natural según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2 que comprende las etapas de:

(1) obtener un anticuerpo humanizado natural mediante un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2;

(2) introducir un ácido nucleico que codifica el anticuerpo humanizado natural en una célula hospedadora; y

(3) cultivar la célula hospedadora.