Un vector de clonación plasmídico, en el que los elementos secuenciales codificados comprenden

a)dos sitios de restricción habituales únicos y no variables que definen un sitio de inserción en 5',

b)un sitio cebador oligonucleotídico,

c)Un par de sitios de endonucleasas de anidación únicos en orientación opuesta que flanquean secuencias nucleotídicas aleatorias,

d)un sitio de restricción habitual único y no variable que permite la clonación de un módulo del vector lanzadera posterior al par de sitios de endonucleasas de anidación,

e)una agrupación fija de sitios de restricción raros no variables,

f)secuencias nucleotídicas aleatorias,

g)una agrupación fija de sitios de restricción raros no variables,

h)un sitio de endonucleasa de anidación único en una orientación directa,

i)un par de sitios de restricción habituales únicos y no variables que flanquean secuencias nucleotídicas aleatorias,

j)un sitio cebador oligonucleotídico,

k)un par de sitios BstX I únicos en orientaciones opuestas, en los que la región nucleotídica variable en el sitio de reconocimiento de BstXI está definido por nucleótidos idénticos a las colas no complementarias generadas por la ordenación de dos sitios de reconocimiento de endonucleasas de anidación idénticos dispuestos en orientación complementaria-inversa,

l)un par de sitios de endonucleasas de anidación únicos en orientaciones opuestas que flanquean secuencias nucleotídicas aleatorias,

m)un sitio cebador oligonucleotídico en orientación inversa,

n)un par de sitios de restricción frecuentes únicos y no variables que flanquean secuencias nucleotídicas aleatorias,

o)un sitio de endonucleasa de anidación único en orientación inversa, siendo el sitio de endonucleasa de anidación el mismo que el sitio de endonucleasa de anidación en una orientación directa,

p)una agrupación fija de sitios de restricción raros no variables,

q)secuencias nucleotídicas aleatorias,

r)una agrupación fija de sitios de restricción raros no variables,

s)un sitio de restricción habitual único y no variable,

t)un par de sitios de endonucleasas de anidación únicos en orientación opuesta que flanquean secuencias nucleotídicas aleatorias,

u)un sitio cebador oligonucleotídico en orientación inversa, y

v)tres sitios de restricción habituales únicos y no variables

Vectores plasmídicos de clonación de ADN y procedimientos para su uso.

Campo de la invención

La presente invención se refiere al campo de los vectores de clonación plasmídicos y al uso de vectores de clonación plasmídicos para construir constructos de ADN o transgenes.

Antecedentes de la invención

El fundamento de la biología molecular es la tecnología de ADN recombinante, que en el presente documento se puede resumir como la modificación y la propagación de ácidos nucleicos con el propósito de estudiar la estructura y la función de los ácidos nucleicos y sus productos proteicos.

Los genes individuales, las regiones reguladoras génicas, las subpoblaciones de genes y, de hecho, los cromosomas enteros dentro de los que están contenidos los anteriores, están todos ellos compuestos por secuencias de nucleótidos bicatenarias antiparalelas que convencionalmente se identifican por las iniciales A, T, G y C. Estas secuencias de ADN, así como las secuencias de ADNc derivadas de las moléculas de ARNm, pueden fragmentarse en fragmentos distintos, aislarse e insertarse en un vector, tal como un plásmido bacteriano, para estudiar los productos génicos. Un plásmido es una pieza de ADN extracromosómico derivado originalmente de bacterias y que se puede manipular y reintroducir en una bacteria huésped con el propósito de estudiar o producir un producto génico. El ADN de un plásmido es similar a todo el ADN cromosómico en cuanto a que está compuesto por los mismos nucleótidos A, T, G y C que codifican genes y regiones reguladoras de los genes, no obstante, es una molécula relativamente pequeña compuesta por menos de aproximadamente 30.000 pares de bases o 30 kilobases (kb). Además, los pares de bases nucleotídicos de un plásmido bicatenario forma una molécula circular, lo que también distingue al ADN del plásmido del ADN cromosómico.

Los plásmidos potencian el rápido intercambio de material genético entre organismos bacterianos y permiten la adaptación rápida a los cambios ambientales, tales como temperatura, suministro de alimentos y otros retos. Cualquier plásmido adquirido debe expresar un gen o genes que contribuyan a la supervivencia del huésped o, de lo contrario, el organismo lo destruirá o desechará dado que el mantenimiento de plásmidos innecesarios sería un uso derrochador de los recursos. Una población clonal de células contiene material genético idéntico, incluidos todos los plásmidos que podría alojar. El uso de un vector de clonación plasmídico con un inserto de ADN en tal población clonal de las células huésped amplificará la cantidad disponible del ADN de interés. El ADN clonado de este modo se puede aislar y recuperar para su posterior manipulación en las etapas requeridas para construir un constructo de ADN. Por tanto, se puede apreciar que los vectores de clonación plasmídicos son herramientas útiles en el estudio de la función génica.

Mientras que algunos elementos encontrados en los plásmidos son naturales, otros se han producido mediante ingeniería para potenciar la utilidad de los plásmidos como vectores de ADN. Estos incluyen genes de resistencia a antibióticos o a sustancias químicas y un sitio de clonación múltiple (MCS) entre otros. Cada uno de estos elementos tiene un papel en la presente invención, así como en la técnica anterior. La descripción del papel que desempeña cada elemento destacará las limitaciones y demostrará la utilidad de la presente invención.

Un gen de transmisión plasmídica particularmente útil que puede adquirir un huésped es uno que conferiría resistencia a antibióticos. En la práctica diaria de la tecnología del ADN recombinante, los genes de resistencia a antibióticos se explotan como elementos de selección positiva o negativa que potencian preferentemente el cultivo y la amplificación del plásmido deseado sobre los de los otros plásmidos.

Con el fin de que pueda ser mantenido por un huésped bacteriano, un plásmido también debe contener un segmento de secuencias que dirigen al huésped a duplicar el plásmido. Las secuencias conocidas como el elemento origen de replicación (ORI) dirigen al huésped para usar sus enzimas celulares para hacer copias del plásmido. Cuando tal bacteria se divide, cada una de las células hijas conservará una copia o copias de cualquiera de dichos plásmidos. Ciertas cepas de la bacteria E. coli se han derivado para maximizar esta duplicación de modo que se producen más de 300 copias por bacteria. De este modo, se puede potenciar el cultivo de un plásmido deseado.

Otro elemento esencial en cualquier vector de clonación es una localización para la inserción de los materiales genéticos de interés. Este es un elemento sintético que se ha sometido a ingeniería dentro de plásmidos "salvajes", de modo que se confiere utilidad como vector de clonación. Todo vector de clonación plasmídico típico disponible comercialmente contiene al menos una de estas regiones, conocida como sitio de clonación múltiple (MCS). Un MCS normalmente comprende secuencias nucleotídicas que pueden fragmentarse por la acción de una sola o de una serie de enzimas endonucleasas de restricción (en lo sucesivo denominadas "enzimas de restricción"), cada una de ellas tiene una secuencia de reconocimiento y un patrón de escisión distintos. Las denominadas secuencias de reconocimiento (que se denominan "sitios" de la enzima de restricción) codificadas en la molécula de ADN comprenden una secuencia palindrómica bicatenaria. Para algunas enzimas de restricción, bastan con sólo 4-6 nucleótidos para proporcionar un sitio de restricción, mientras que algunas enzimas de restricción requieren una secuencia de 8 o más nucleótidos. Por ejemplo, la enzima EcoR1 reconoce la secuencia hexanucleotídica; ^5' G-A-A-T-T-C ^3', en la que 5' indica el extremo de la molécula conocido por consenso como el extremo "anterior" y, asimismo, 3' indica el extremo "posterior". La hebra complementaria de la secuencia de reconocimiento sería su hebra antiparalela, ^3' G-A-A-T-T-C-^5'. Por tanto, el sitio de reconocimiento de doble cadena puede estar representado dentro de la molécula bicatenaria más grande en la que aparece como:

Como muchas otras enzimas de restricción, EcoR1 no fragmenta exactamente en el eje de la simetría de la díada, sino en posiciones alejadas cuatro nucleótidos en las dos hebras de ADN entre los nucleótidos indicados por una "/".

de modo que la molécula de ADN bicatenaria se fragmenta y tiene la configuración resultante de nucleótidos en los "extremos" recién formados:

Esta fragmentación escalonada proporciona fragmentos de ADN con términos 5' protruyentes. Dado que los pares A-T y G-C se forman de modo espontáneo cuando están cercanos, los extremos que protruyen como estos se denominan extremos cohesivos o adhesivos. Uno cualquiera de estos extremos puede formar puentes de hidrógeno con cualquier otro extremo complementario fragmentado con la misma enzima de restricción. Dado que cualquier ADN que contiene una secuencia de reconocimiento específico se cortará del mismo modo que cualquier otro ADN que contiene la misma secuencia, los extremos escindidos serán complementarios. Por tanto, los extremos de cualquier molécula de ADN cortada con la misma enzima de restricción "coinciden" entre sí del mismo modo que piezas adyacentes de un puzzle "coinciden", y pueden unirse enzimáticamente. Es esta propiedad la que permite la formación de moléculas de ADN recombinantes y permite la introducción de fragmentos de ADN extraño en los plásmidos bacterianos o en cualquier otra molécula de ADN.

Otro principio general que se debe considerar al construir moléculas de ADN recombinante es que todos los sitios de restricción que se encuentren dentro de una molécula se cortarán con una enzima de restricción concreta, no sólo el sitio de interés. Cuanto más grande es una molécula de ADN, mayor es la probabilidad de que vuelva a aparecer cualquier sitio de restricción. Suponiendo que todos los sitios de restricción se distribuyen de forma aleatoria a lo largo de una molécula de ADN aparecerá un sitio tetranucleotídico, de media, una vez cada 4⁴ (es decir, 256) nucleótidos, mientras que un sitio...

1. Un vector de clonación plasmídico, en el que los elementos secuenciales codificados comprenden

2. El vector de clonación plasmídico de la reivindicación 1, en el que la estructura modular de los elementos secuenciales está ordenada para permitir la introducción de dos transgenes discretos, de modo que las secuencias nucleotídicas introducidas de este modo sustituyen las secuencias nucleotídicas aleatorias.

3. El vector de clonación plasmídico de la reivindicación 1, en el que la estructura modular de los elementos secuenciales está ordenada para permitir la introducción de dos regiones discretas de secuencias nucleotídicas tales como las necesarias para inducir la recombinación homóloga de un transgen para alcanzar la mutación dirigida de un gen.

4. El vector de clonación plasmídico de la reivindicación 1, en el que la estructura modular de los elementos secuenciales está ordenada para permitir la introducción de dos elementos distintos de selección positiva o negati- va.