Uso de un vector que contiene una secuencia de ADN que comprende un promotor,

un fragmento de la región 5' no traducida del gen temprano inmediato de citomegalovirus humanos (IE1 de HCMV) que incluye todo el exón 1 pero en el que no están presentes más de 50 bases consecutivas del intrón A, y una secuencia de ADN que codifica un polipéptido unido de manera operable con el promotor y el fragmento de la región 5' no traducida del gen IE1 de HCMV, en la preparación de una composición de vacuna para aumentar una respuesta inmune contra dicho polipéptido

Vectores de expresión de ADN.

Campo de la invención

La invención se refiere al uso de vectores de ADN que contienen una secuencia reguladora de la transcripción derivada del gen temprano inmediato principal de citomegalovirus humano en la preparación de composiciones de vacuna para aumentar una respuesta inmune. En particular, la invención proporciona vectores que contienen una región promotora mínima y un fragmento de la región 5' no traducida del gen temprano inmediato principal de citomegalovirus humano que incluye el exón 1 pero no el intrón A.

Antecedentes de la invención

Se sabe usar el promotor y las regiones potenciadoras en la dirección 5' del gen temprano inmediato principal de citomegalovirus humano (abreviado en el presente documento como cono IE1 de HCMV) para impulsar la expresión de las proteínas recombinantes. Por ejemplo, la patente europea con número EP 0 323 997 B describe vectores de expresión que incorporan el promotor, el potenciador en la dirección 5' y la región 5' no traducida funcionalmente completa del gen IE1 de HCMV, que incluye el primer intrón. En dichas construcciones, la 5' UTR de IE1 de HCMV está unida directamente a la región de codificación de un gen heterólogo, que sustituye a la 5' UTR natural del gen heterólogo. La inclusión de la 5' UTR de longitud completa potencia significativamente los niveles de expresión más allá de los observados con el promotor mínimo de IE1 de HCMV solo.

Se acepta por lo general que la expresión potenciada observada en presencia de la 5' UTR de IE1 de HCMV completo se puede es atribuir a la inclusión del primer intrón (denominado como intrón A o intrón 1). Los presentes inventores han observado ahora sorprendentemente que el uso de un fragmento de la 5' UTR que incluye el exón 1 pero que carece del primer intrón, da como resultado una expresión potenciada sobre y por encima de los niveles de expresión alcanzados con el promotor mínimo de IE1 de HCMV solo. Además, la sustitución del intrón A natural de IE1 de HCMV con un intrón heterólogo da como resultado una expresión potenciada. El potenciamiento de la expresión mediante el uso del exón 1 en ausencia del intrón A fue completamente inesperado en base al conocimiento previo del comportamiento del promotor mínimo de HCMV y la 5' UTR.

La 5' UTR natural del gen IE1 de HCMV es relativamente grande (1021 bases). El uso del exón 1 en ausencia del intrón A tiene el potencial de permitir minimizar el tamaño del promotor/5' UTR, a la vez que se mantiene una expresión eficaz de las proteínas recombinantes. Esto tendrá utilidad en el campo de las vacunas de ADN, en el que es ventajoso minimizar la longitud de las secuencias no codificantes incluidas en una construcción de una vacuna de ADN, y también en vectores plásmidos que contienen múltiples casetes de expresión en los que minimizará la posibilidad de recombinación a través de las secuencias homólogas en el interior del plásmido.

Descripción de la invención

En un primer aspecto, la invención proporciona el uso de un vector que contiene una secuencia de ADN que comprende un promotor, un fragmento de la región 5' no traducida del gen IE1 de HCMV que incluye la totalidad del exón 1 pero en el que no están presentes más de 50 bases consecutivas del intrón A, y una secuencia de ADN que codifica un polipéptido unido de manera operable al promotor y el fragmento de la región 5' no traducida del gen IE1 de HCMV, en la preparación de una composición de vacuna para aumentar una respuesta inmune contra dicho polipéptido.

La invención se basa en la observación de que un fragmento de la región 5' no traducida de IE1 de HCMV que incluye el exón 1 pero no el intrón A es capaz de potenciar el nivel de expresión de un promotor básico, tal como el promotor mínimo de IE1 de HCMV.

Un promotor puede definirse por lo general como una región de ADN que es capaz de dirigir el inicio de la transcripción mediante la ARN polimerasa. El promotor usado en la presente invención puede ser esencialmente cualquier promotor dependiente de la ARN polimerasa II.

En una realización preferida, el promotor puede ser el promotor mínimo de IE1 de HCMV. Se puede definir un promotor mínimo de IE1 de HCMV como un fragmento de la región del promotor de IE1 de HCMV que es capaz de funcionar como un promotor, impulsando la transcripción desde el lugar de inicio de la transcripción natural. Por ejemplo, un fragmento del gen IE1 de HCMV que comprende los nucleótidos -116 a +1, siendo el nucleótido +1 el lugar de inicio de la transcripción de IE1 de HCMV, que presenta actividad de promotor.

El fragmento de la región 5' no traducida de IE1 de HCMV se situará como lo más preferible inmediatamente en 3' a (es decir, en la dirección 3' de) el promotor, de tal manera que la secuencia 5' no traducida de HCMV estará incluida en las transcripciones que se inician en el lugar de inicio de la transcripción asociado con el promotor. En la Figura 5 adjunta se ilustra la secuencia de nucleótidos del exón 1 de IE1 de HCMV procedente de la cepa Towne de HCMV. Sin embargo, no se pretende que el término "un exón 1 de IE1 de HCMV" esté limitado a esta secuencia precisa Este término abarca también las variantes menores, que incluyen las secuencias del exón 1 procedentes de otras cepas de HCMV, tales como AD169. El exón 1 procedente de AD169 está entre 514-634 de la secuencia dada a conocer por A Krigg, A. y col Virus research 2, 107-121 (1985)y también las secuencias variantes que presentan sustituciones, inserciones, adiciones y delecciones de bases. El lector experto apreciará que puede llevarse a cabo la variación menor en la secuencia del exón 1 sin afectar sustancialmente su capacidad para potenciar la expresión procedente de un promotor asociado.

En una realización, el vector puede comprender adicionalmente un intrón heterólogo, es decir, un intrón diferente del intrón A del gen IE1 de HCMV, situado inmediatamente en la dirección 3' del exón 1 de IE1 de HCMV. El intrón heterólogo puede sustituir el intrón A natural en la 5' UTR de IE1 de HCMV, en cuyo caso, la parte no traducida del exón 2 de IE1 de HCMV puede estar incluida inmediatamente en la dirección 3' del intrón heterólogo. El intrón heterólogo puede producirse de manera sintética o natural diferente de la del intrón A. El intrón heterólogo se transcribirá junto con el fragmento de la región 5' no traducida de IE1 de HCMV, que forma parte de la 5' UTR de la transcripción resultante. Se puede localizar el intrón A de AD169 en la posición 635-1461 de la secuencia dada a conocer por A Krigg. A. y col. más arriba.

Tal como se ilustra en los ejemplos adjuntos, la inclusión de un intrón heterólogo puede aumentar los niveles de expresión por encima de los alcanzados usando solo un promotor y el exón 1. Ventajosamente, el intrón heterólogo será corto (preferiblemente menos de 100 bases) con el fin de reducir la cantidad de secuencia no codificante presente en el vector. Un ejemplo adecuado es el primer intrón del gen CD68 humano que tiene 87 bases de longitud, pero se pueden usar otros intrones heterólogos con efecto equivalente.

El vector puede incluir además lugares de restricción para permitir la inserción de una secuencia heteróloga de codificación. Los lugares de restricción se situarán preferiblemente en la dirección 3' del fragmento 5' no traducido de IE1 de HCMV, incluyendo cualquier intrón heterólogo que se pueda incluir en el vector.

El vector puede incluir uno o más elementos reguladores de la transcripción, adicionales, además del promotor, tales como los elementos potenciadores. Por ejemplo, los vectores que contienen el promotor mínimo de IE1 de HCMV pueden incluir adicionalmente el elemento potenciador de IE1 de HCMV. Lo más preferible, el elemento potenciador se situará inmediatamente en la dirección 5' del promotor mínimo de IE1 de HCMV.

En una realización preferida, el vector puede ser un plásmido. Un vector plásmido puede contener adicionalmente un origen de la replicación para permitir la replicación autónoma en el interior de una célula huésped procariota y un marcador selectivo, tal como un gen de resistencia a antibiótico. El vector puede contener también un finalizador pol II para finalizar la transcripción y una señal de poliadenilación para la estabilización y el procesamiento del extremo 3' de un ARNm transcrito procedente del promotor. Ventajosamente, pueden estar incluidos uno o más lugares de transcripción entre la secuencia de la 5' UTR de IE1 de HCMV y la señal de poliadenilación para...

1. Uso de un vector que contiene una secuencia de ADN que comprende un promotor, un fragmento de la región 5' no traducida del gen temprano inmediato de citomegalovirus humanos (IE1 de HCMV) que incluye todo el exón 1 pero en el que no están presentes más de 50 bases consecutivas del intrón A, y una secuencia de ADN que codifica un polipéptido unido de manera operable con el promotor y el fragmento de la región 5' no traducida del gen IE1 de HCMV, en la preparación de una composición de vacuna para aumentar una respuesta inmune contra dicho polipéptido.

2. Uso de un vector según se define en la reivindicación 1 en la preparación de una composición inmunoterapéutica.

3. Uso de un vector según la reivindicación 1 ó 2 en el que el promotor es un promotor mínimo de IE1 de HCMV.

4. Uso de un vector según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en el que el fragmento de la región 5' no traducida del gen IE1 de HCMV se sitúa inmediatamente en 3' con el promotor.

5. Uso de un vector según la reivindicación 4 que comprende además una secuencia heteróloga de intrón diferente de la del intrón A del gen IE1 de HCMV situado inmediatamente en la dirección 3' del exón 1 de IE1 de HCMV en la región 5' no traducida.

6. Uso de un vector según la reivindicación 4 o la reivindicación 5 que comprende además uno o más lugares de restricción situados en la dirección 3' de la región 5' no traducida.

7. Uso de un vector según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 que es un vector plásmido.

8. Uso de un vector según la reivindicación 1 en el que el polipéptido es un péptido antigénico.

9. Uso de un vector según la reivindicación 1 a 8, comprendiendo dicha composición de vacuna un diluyente, excipiente o vehículo adyuvante farmacéuticamente aceptable.

10. Uso de un vector según la reivindicación 9 cuyo vehículo comprende una perla sobre la cual se recubre el vector.

11. Un vector que contiene una secuencia de ADN que comprende un promotor y un fragmento de la región 5' no traducida del gen IE1 de HCMV que incluye todo el exón 1 pero en el que no están presentes más de 50 bases consecutivas del intrón A y una secuencia de ADN que codifica un péptido antigénico, para uso como una vacuna, o composición inmunoterapéutica o como componente de una composición de vacuna o composición inmunoterapéutica.