Molécula de ácido nucleico que comprende las secuencias que codifican las proteínas de la envoltura y de la premembrana del virus del Nilo Occidental y las proteínas no estructurales y de la cápsida del virus de la fiebre amarilla,

en la que dicha proteína de la envoltura comprende una mutación atenuante en la posición 107

Vacuna del virus del Nilo Occidental.

La presente invención se refiere a vacunas contra el virus del Nilo Occidental

Antecedentes de la invención

Desde que se detectara por primera vez en el hemisferio norte, el virus del Nilo Occidental (WN) ha seguido propagándose con rapidez por toda Norteamérica. Los primeros casos se diagnosticaron en 1999 en el área de Nueva York. En el año 2002, el índice de mortalidad humana aumentó hasta más de 150 casos y su propagación ha continuado hasta llegar a California. La aparición de pájaros infectados o muertos indica la existencia de un grupo significativo de mosquitos infectados en las áreas geográficas de incidencia. Hasta la fecha, no existe un tratamiento farmacológico eficaz contra el virus del Nilo Occidental, y los métodos de vigilancia y prevención no han tenido un impacto significativo en el número de casos de infección en humanos. Por lo tanto, los riesgos de migración del virus al hemisferio sur del continente americano y de surgimiento de epidemias en países industrialmente menos desarrollados son extremadamente elevados.

El virus del Nilo Occidental es un miembro de la familia Flavivirus. Estos virus son pequeños, con envoltura y de ARN de cadena positiva que resultan de interés en el ámbito médico y veterinario mundial. Entre los ejemplos de este género de virus se encuentran, además del virus del Nilo Occidental, el virus de la fiebre amarilla, el virus de la encefalitis japonesa y el virus del dengue.

Las proteínas de los flavivirus se producen mediante la traducción de un marco de lectura abierto largo y único para generar una poliproteína que sufre una compleja serie de divisiones proteolíticas postraduccionales por medio de una combinación de proteasas huésped y virales, para generar proteínas virales maduras (Amberg y col., J. Virol., 73:8083-8094, 1999; Rice, "Flaviviridae", Virology, Fields (ed.), Raven-Lippincott, Nueva York, 1995, Volumen I, p. 937). Las proteínas estructurales del virus se organizan en la poliproteína con la forma C-prM-E, donde "C" es la cápsida, "prM" (o "premembrana") es una precursora de la proteína M (de membrana) ligada a la envoltura y "E" es la proteína de la envoltura. Estas proteínas están presentes en la región del extremo amino de la poliproteína, mientras que las proteínas no estructurales (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B y NS5) están localizadas en la región del extremo carboxilo de la poliproteína.

Sumario de la invención

La invención proporciona moléculas de ácido nucleico que incluyen las secuencias que codifican las proteínas de la envoltura y de la premembrana del virus del Nilo Occidental y las proteínas no estructurales y de la cápsida del virus de la fiebre amarilla. Las proteínas de la envoltura o de la premembrana del virus del Nilo Occidental de estas quimeras comprenden una o varias mutaciones atenuantes como, por ejemplo, la sustitución de aminoácidos en las posiciones 107, 316 y/o 440 de la proteína de la envoltura. Como ejemplos específicos la sustitución de aminoácidos en la posición 107 puede ser de leucina por fenilalanina (o un aminoácido conservador de la misma); la sustitución de aminoácido en la posición 316 puede ser de alanina por valina (o un aminoácido conservador de la misma); y la sustitución en la posición 440 puede ser de lisina por arginina (o un aminoácido conservador de la misma).

La invención también incluye flavivirus híbridos codificados por las moléculas de ácidos nucleicos descritas en la presente memoria, así como distintas utilizaciones de los mismos, con el fin de inducir en un individuo una respuesta inmune al virus del Nilo Occidental. Además, la invención incluye la utilización de dichos flavivirus híbridos en vacunaciones y para preparar medicamentos destinados a tales usos. Las utilizaciones descritas en la presente memoria se aplican a individuos con riesgo de desarrollar el virus del Nilo Occidental pero que no lo han contraído, así como a sujetos infectados por el virus del Nilo Occidental. La invención también proporciona métodos para producir los flavivirus híbridos descritos en la presente memoria.

La invención proporciona varias ventajas. Por ejemplo, tal y como se expone a continuación con mayor detalle, las mutaciones atenuantes de los virus de la invención tienen como resultado una reducción de la neurovirulencia, pero no afectan de forma adversa a la capacidad de los virus para inducir una respuesta inmune efectiva. Por lo tanto, los virus de la invención proporcionan un enfoque eficaz y seguro para la prevención y el tratamiento de la infección del virus del Nilo Occidental.

Otras características y ventajas de la invención resultarán evidentes a partir de la descripción detallada siguiente y las reivindicaciones que se exponen a continuación.

Breve descripción del dibujo

La figura 1 es un gráfico que representa los resultados del valor de los anticuerpos neutralizantes recíprocos (PRNT₅₀) en ratones ICR vacunados con YF/WN wt o YF/WN_FVR. Se representan los valores de los anticuerpos neutralizantes contra el virus YF/WN wt. Los símbolos blancos representan a los ratones que no sobrevivieron a la reinmunización IP con la cepa WNV NY-99. Se obtuvo una supervivencia del 100% en los grupos vacunados con una dosis de 10³ PFU de YF/WN wt y con una dosis de 10⁵ PFU de YF/WN_FVR. Del grupo de ratones vacunado con 10³ PFU de YF/WN_FVR sólo sobrevivió a la reinmunización el 40%.

Descripción detallada

La invención proporciona vacunas y utilizaciones para la prevención y el tratamiento de la infección del virus del Nilo Occidental (WN). Las utilizaciones de la invención implican la utilización de un flavivirus híbrido atenuado compuesto de un virus de la fiebre amarilla en el que las proteínas de la envoltura y la premembrana se han sustituido por las del virus del Nilo Occidental conforme a la invención para la vacunación de un individuo. Las proteínas del virus del Nilo Occidental de las quimeras de la invención incluyen una o varias mutaciones atenuantes, tal y como se detalla a continuación.

Los métodos generales de creación y administración de flavivirus híbridos que puedan ser utilizados en la presente invención aparecen descritos detalladamente, por ejemplo, en las solicitudes de patente US nº 09/007,664, 09/121,587 y 09/452,638; en las solicitudes internacionales PCT/US98/03894 (WO 98/37911) y PCT/US00/32821 (WO 01/39802); y en el documento de Chambers y col., J. Virol., 73:3095-3101,1999. Tal y como se expone a continuación, para la utilización de acuerdo con la presente invención se insertan una o varias mutaciones atenuantes en las secuencias del virus del Nilo Occidental. En el documento PCT/US03/01319 (WO 03/060088 A2) también se describen métodos que se pueden usar para producir virus en la invención.

En un ejemplo de un virus híbrido de la invención, la mutación atenuante se encuentra en la posición 107, o en la posición 316 y en la 440 (o en una combinación de las mismas), de la proteína de la envoltura del virus del Nilo Occidental. Como ejemplo específico, y utilizando como referencia la secuencia de la cepa del virus del Nilo Occidental flamenco-NY99 382-99 (número de registro del GenBank AF196835), la lisina se puede sustituir por fenilalanina en la posición 107, la alanina se puede sustituir por valina en la posición 316 y/o la lisina se puede sustituir por arginina en la posición 440. Además de los aminoácidos indicados, también se pueden hacer sustituciones con otros aminoácidos, como los que producirían una modificación conservadora al sustituir a los aminoácidos mencionados. Las sustituciones conservadoras habituales comprenden las de los grupos siguientes: glicina, alanina, valina, isoleucina y leucina; ácido aspártico, ácido glutámico, asparagina y glutamina; serina y treonina; lisina y arginina; y fenilalanina y tirosina. En un ejemplo específico, una quimera de la invención incluye cada una de las sustituciones específicas indicadas anteriormente. Además, tal y como se expone a continuación, los residuos adicionales (por ejemplo, las posiciones 138, 176 y/o 280) también se pueden alterar en los virus híbridos de la presente invención.

Las vacunas de la invención se pueden administrar en cantidades y con métodos que el experto en la materia puede determinar con facilidad. Las vacunas se pueden administrar y formular, por ejemplo, en forma de fluido cultivado a partir de cultivos celulares infectados...

1. Molécula de ácido nucleico que comprende las secuencias que codifican las proteínas de la envoltura y de la premembrana del virus del Nilo Occidental y las proteínas no estructurales y de la cápsida del virus de la fiebre amarilla, en la que dicha proteína de la envoltura comprende una mutación atenuante en la posición 107.

2. Molécula de ácido nucleico que comprende las secuencias que codifican las proteínas de la envoltura y de la premembrana del virus del Nilo Occidental y las proteínas no estructurales y de la cápsida del virus de la fiebre amarilla, en la que dicha proteína de la envoltura comprende una mutación atenuante en la posición 316 y en la posición 440.

3. Molécula de ácido nucleico según la reivindicación 1, en la que dicha mutación atenuante comprende además una sustitución de aminoácido en las posiciones de aminoácido 316 y 440.

4. Molécula de ácido nucleico según la reivindicación 1 ó 3, en la que dicha sustitución de aminoácido en la posición 107 es de la leucina por la fenilalanina, o un aminoácido conservador de la misma.

5. Molécula de ácido nucleico según la reivindicación 2 ó 3, en la que dicha sustitución de aminoácido en la posición 316 es de la alanina por la valina, o un aminoácido conservador de la misma.

6. Molécula de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 2, 3 ó 5, en la que dicha sustitución de aminoácido en la posición 440 es de la lisina por la arginina, o un aminoácido conservador de la misma.

7. Flavivirus híbrido codificado por la molécula de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

8. Utilización del flavivirus híbrido según la reivindicación 7 para la preparación de una composición farmacéutica para inducir una respuesta inmune al virus del Nilo Occidental en un sujeto.

9. Utilización según la reivindicación 8, en la que dicho individuo se halla en riesgo de desarrollar una infección del virus del Nilo Occidental, pero no la ha contraído.

10. Utilización según la reivindicación 8, en la que dicho sujeto está infectado con el virus del Nilo Occidental.

11. Procedimiento de preparación de una vacuna de flavivirus híbrido, que comprende la introducción en las células de la molécula de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

12. Utilización del flavivirus híbrido según la reivindicación 7 para la preparación de una composición farmacéutica para la vacunación contra el virus del Nilo Occidental.