La presente invención se refiere al uso de inhibidores del NF-kB in vitro para inducir la depleción selectiva de linfocitos T alorreactivos tras cultivo mixto.

En particular la presente invención se refiere al uso in vitro de inhibidores del NF-kB, preferiblemente inhibidores de la proteosoma y más preferiblemente bortezomib, en cultivos mixtos de linfocitos (MLR) para inducir la depleción selectiva de los linfocitos T alorreactivos y disminuir la producción de citoquinas Th1. Así como a composiciones farmacéuticas y su uso en terapia

Uso de inhibidores del NF-?B in vitro para inducir la depleción selectiva de linfocitos T alorreactivos, composiciones farmacéuticas derivadas y usos de las mismas.

Campo de la técnica

La presente invención se refiere al uso de inhibidores del NF-?B in vitro para inducir la depleción selectiva de linfocitos T alorreactivos tras cultivo mixto. En particular la presente invención se refiere al uso in vitro de inhibidores del NF-?B, preferiblemente inhibidores de la proteosoma y más preferiblemente bortezomib, en cultivos mixtos de linfocitos (MLR) para inducir la depleción selectiva de los linfocitos T alorreactivos y disminuir la producción de citoquinas Th1. Así como a composiciones farmacéuticas y su uso en terapia.

Antecedentes de la invención

El término de NF-?B es una definición colectiva que hace referencia a los factores de transcripción dimérica que pertenecen a la familia Re1, y que se regulan a través de intercambios entre el citoplasma y el núcleo, en respuesta a la estimulación celular ⁽¹⁾. La familia NF-?B ha surgido como un transductor clave de señales inflamatorias que intervienen en la maduración de las células dendríticas y en la activación de los linfocitos T ^(2-4). En consecuencia, las diversas vías de señalización situadas a continuación de TCR/CD3 convergen en diversos factores clave de transcripción, incluidos el NFAT, AP-1 y NF-?B ⁽⁵⁾. La activación del factor NF-?B es esencial para las respuestas inmunogénicas de las células T, pero no para las tolerogénicas, mientras que las proteínas NFAT desempeñan funciones tanto inmunogénicas como tolerogénicas ^(6-9). Además, el factor NF-?B activa múltiples genes-diana, cuyos productos pueden inhibir la apoptosis, estando íntimamente vinculadas tanto la actividad anti-apoptótica como la respuesta inmunogénica ⁽¹⁰⁾.

Bortezomib, un dipéptido del ácido borónico es un inhibidor potente, selectivo y reversible, de la proteaso-ma ^(11-12). La proteasoma es un complejo multienzimático presente en todas las células. Degrada las proteínas que regulan el avance del ciclo celular Este último bloquea la translocación nuclear y la actividad transcripcional del factor NF-?B. Bortezomib ha mostrado citotoxicidad contra una amplia gama de líneas de células tumorales humanas que expresan de forma constitutiva la actividad del factor NF-?B ^(14,15). En los linfocitos T normales, la translocación del factor NF-?B al núcleo sólo ocurre después de contacto con TCR/CD3 y otras moléculas co-estimuladoras ^(3,16), mientras que no se activa en los linfocitos T en reposo.

Uno de los principales desafíos en el trasplante de las células madre o troncales hematopoyéticas alogénicas es el de impedir la alorreactividad que lleva a la reacción del injerto frente al huésped (GVHD), sin dejar por ello de mantenerse el efecto del injerto frente a la leucemia (GVL) ^(16,17) Algunos datos in vitro apoyan la existencia, en el interior de las células T, de alorrespuestas limitadas a determinadas líneas hematopoyéticas ⁽¹⁸⁾. El bloqueo del factor NF-?B podría llevar a la depleción de los linfocitos T activados en un cultivo de linfocitos mezclados, dirigiéndose así selectivamente a las células T alorreactivas. Además, el bloqueo del factor NF-?B en condiciones de activación in vitro podría inducir una sobreexpresión de vías intracelulares alternativas, modificándose de ese modo el tipo de respuesta inmune. Es importante señalar que, en un estudio anterior, se ha descrito la demostración de que el uso de bortezomib podría prevenir la GVHD en un modelo de ratón ⁽¹⁹⁾. En el presente trabajo demostramos que, en células humanas, bortezomib se dirige selectivamente a las células T alorreactivas que inducen la apoptosis a las concentraciones que se alcanzan en el entorno clínico. Además, se modifica el comportamiento de las citoquinas, ya que la droga induce una menor producción de citoquinas Th1, que son las que intervienen en el desarrollo de la reacción GVHD.

Breve descripción de la invención

Un primer aspecto de la invención se refiere al uso de inhibidores del NF-?B in vitro para generar la depleción selectiva de linfocitos T alorreactivos. En un aspecto preferido de la invención dichos inhibidores del NF-?B son inhibidores de la proteosoma. En un aspecto aún más preferido de la invención, dicho inhibidor de la proteosoma es bortezomib.

Un segundo aspecto de la invención se refiere al uso de los inhibidores de la invención para generar la depleción selectiva de los linfocitos T alorreactivos tras cultivo mixto. En un aspecto preferido de la invención dicho cultivo mixto comprende linfocitos del donante y células mononucleadas del receptor. En un aspecto aún más preferido de la invención, dicho cultivo mixto comprende linfocitos del donante y células dendríticas del receptor. En una realización aún más preferida de la invención dicho cultivo mixto comprende linfocitos del donante y células de estirpe endotelial o epitelial del receptor.

Un tercer aspecto de la invención se refiere al uso del producto obtenido tras la utilización de los inhibidores de la invención en el cultivo mixto para la elaboración de una composición farmacéutica. En un aspecto preferido de la invención dicha composición farmacéutico se utiliza en terapia. En un aspecto más preferido de la invención dicha composición farmacéutica se utiliza en el tratamiento de transplantes, más preferiblemente en el tratamiento de transplantes hematopoyéticos.

Descripción de las figuras

Figura 1: Inhibición del crecimiento inducido por Bortezomib en linfocitos T, evaluada por MTT. Los resultados se expresan como porcentaje de la absorbancia a 570 nM, usando un espectrofotómetro que considera el 100% como el valor correspondiente de la muestra incubada sin bortezomib (0 nM). Se observaron diferencias significativas (p<0,01) en el crecimiento de las células entre los linfocitos T estimulados con PHA, los MLR y los controles para las diferentes concentraciones de la droga (n=11); cuando se cultivaban los linfocitos T con células dendríticas (DC) alogénicas irradiadas, los linfocitos T mostraban un comportamiento proliferativo intermedio entre los cultivos estimulados con PHA y con MLR (n=9); se observaron diferencias significativas (p<0,01), en términos de porcentaje de inhibición del crecimiento, dentro de los linfocitos T estimulados con PHA, MLR o DC irradiadas, según la concentración de bortezomib

Figura 2: Análisis Western blot de la expresión de NF-?B (A) y IkB (B) en las células de control o las estimuladas por PHA, expuestas a bortezomib 100 nM durante diferentes periodos de tiempo.

Figura 3: Viabilidad de las células evaluadas por citometría de flujo a través de coloración con Annexin V-PE y 7-AAD: (3A) entre linfocitos T estimulados con PHA (>70% de acontecimientos CD25+ en todos los casos), la viabilidad celular disminuye significativamente cuando aumenta la concentración del fármaco; porcentaje medio (más desviación típica) de las células CD3 negativas con Annexin V PE y 7 AAD (linfocitos T viables) para las diferentes dosis de Bortezomib en muestras estimuladas con PHA: 42,13 (7,03) a 0 nM; 46,14 (9,47) a 1 nM; 35,85 (12,24) a 10 nM; 21,2 (11,9) a 100 nM y 12,87 (7,72) at1000 nM; (3B) entre los linfocitos T en reposo sólo una minoría de las células expresan CD25 (<3% CD25+ acontecimientos en todos los casos). La viabilidad de las células evaluadas como acontecimientos negativos a la coloración con Annexin V-PE y 7-AAD no queda significativamente afectada por los incrementos en la concentración de la droga; porcentaje medio (pm de desviación típica) de células positivas al CD3 negativo coloreadas con Annexin V PE y 7 AAD (linfocitos T viables) para las diferentes dosis de Bortezomib en muestras no estimuladas: 60,64 (6,03) a 0 nM; 65,6 (3,04) a 1 nM; 64,6 (3,37) a 10 nM; 63,21 (4,96) a 100 nM y 53,08 (4,32) a 1000 nM; (3C) Comparación del porcentaje de células positivas al CD3 y negativas a la coloración con Annexin V-PE y 7-AAD entre los linfocitos T estimulados con PHA y no estimulados (de control) a las diferentes dosis de bortezomib.

Figura 4: Las muestras fueron adquiridas con un número calibrado de Tubos Trucount^MR de gránulos fluorescentes (BD) a fin de calcular el recuento absoluto de células negativas a la coloración con Annexin V-PE más 7-AAD entre las células T en reposo (CD25 -) y alorreactivas (CD25 +). Los números especificados en las figuras...