Un procedimiento para purificar un lipopéptido usando un modificador de fase móvil en un sistema de cromatografía en fase normal para mejorar la selectividad y/o la productividad de la purificación,

en el que el modificador de fase móvil está seleccionado de un grupo constituido por una amina, un aminoácido o un éster de aminoácido, el sistema de cromatografía en fase normal incluye una fase móvil y una fase estacionaria, la fase móvil es un sistema disolvente que comprende uno o más disolventes, la fase estacionaria está seleccionada de gel de sílice y alúmina, y la amina está seleccionada del grupo constituido por: metilamina, etilamina, diisopropilamina, dietilamina, etilmetilamina, trietilamina, propilamina, anilina y dimetilanilina

Uso de aminas, aminoácidos o ésteres de aminoácidos como modificadores de fase móvil en cromatografía.

Referencia cruzada a solicitudes relacionadas

La presente solicitud reivindica el beneficio de la Solicitud Provisional de los Estados Unidos N.º: 60/422.356, presentada el 30 de octubre de 2002.

Campo de la presente invención

La presente invención se refiere al uso de amidas, aminoácidos o ésteres de aminoácidos como modificadores de fase móvil en cromatografía de fase normal de compuestos de lipopéptidos.

Antecedentes de la presente invención

En el pasado, la resolución de impurezas clave tales como Pneumocandinas B₅ y E₀ a partir de Pneumocandina B₀ en la purificación de HPLC en gel de sílice era pobre. Algunos análogos resolvieron sólo parcialmente a partir del producto principal picos según las condiciones de preparación. Para lograr la pureza del producto deseada, la resolución limitada requería que la etapa de purificación se hiciera funcionar a baja carga de columna, lo que limitaba la productividad.

Los lipopéptidos, tales como Pneumocandina B₀, son a menudo el producto de un procedimiento de fermentación. Durante un procedimiento de fermentación tal, se producen análogos muy cercanamente seleccionados junto con el producto deseado. Los sistemas de cromatografía en fase normal se usan frecuentemente para purificar el producto de fermentación en bruto. Un sistema de cromatografía en fase normal consiste usualmente en una fase estacionaria y una fase móvil. Para purificación de un péptido o lipopéptido, la fase estacionaria puede ser sílice o alúmina, y la fase móvil puede ser un disolvente individual o una mezcla de disolventes, que incluye los disolventes orgánicos y el agua.

La cromatografía en gel de sílice y otros tipos de la cromatografía en fase normal son útiles para separar estos análogos. Sin embargo, en la práctica, la resolución de ciertos análogos cercanos a partir del producto deseado es a menudo pobre y no satisfactoria, debido a que la resolución no es grande y a menudo hay solapamiento. Lograr la pureza deseada del producto principal a un rendimiento razonable requiere restringir la cantidad de material (a menudo referida como alimento o carga de columna) cargado sobre la columna por ejecución, lo que limita la productividad de la operación.

La purificación de Pneumocandina B₀ cae dentro de esta categoría. La cromatografía utiliza una fase móvil constituida por una mezcla de disolventes, específicamente acetato de etilo (EtOAc), metanol (MeOH) y agua, en una columna de gel de sílice. La Pneumocandina B₀, con un peso molecular de 1065 daltons, es un producto natural y sirve como un intermedio en la producción de acetato de Caspofungina (Cancidas@). La Pneumocandina B₀ se produce como un metabolito secundario por fermentación del hongo Glarea lozoyensis. Véanse Patentes de los Estados Unidos N.^os 5,194,377 y 5,202,309. Las estructuras de Pneumocandina B₀ y dos de las impurezas análogas clave, todas compren- didas en un hexapéptido cíclico acoplado con cadena lateral de dimetilmiristato, se muestran en Fórmula I y Tabla 1.

Fórmula I

La cromatografía en gel de sílice explota las variaciones sutiles en afinidad de unión del núcleo de hexapéptido cíclico rico en hidroxi del producto deseado y de las impurezas de análogos, incluyendo Pneumocandinas B₅ y E₀, para llevar a cabo una separación. En la purificación de HPLC en gel de sílice, las Pneumocandinas B₅ y E₀, dos de las impurezas clave coproducidas en la fermentación de Pneumocandina B₀, eluyen muy cerca de Pneumocandina B₀. Por lo tanto, para encontrar los niveles de impureza objetivo en el material purificado para éstos y compuestos análogos similares, la cantidad de Pneumocandina B₀ en bruto que se puede cargar en la columna es limitada. Como un resultado, se han hecho esfuerzos significativos para mejorar la resolución de las impurezas clave. Por ejemplo, la fase móvil de acetato de etilo-metanol-agua ternaria se ha equilibrado para optimizar la resolución entre Pneumocandina B₀ e impurezas análogas clave. D.J. Roush, F.D. Antia, K.E. Goklen J. Chromatography A, 827 (1998) 373-389. T. Yoshida y T. Okada, J. Chromatography A, 840 (1999) 1-9, describen efectos de fase móvil en separaciones peptídicas usando cromatografía en fase líquida. Se revelan efectos similares en el documento JP 11-023558.

Sumario de la presente invención

La presente invención divulga el uso de modificadores de fase móvil, incluyendo aminoácidos, ésteres de aminoácidos o aminas, durante la purificación de HPLC de un lipopéptido. Los modificadores de fase móvil se unen a la fase estacionaria y modifican las características de unión de la fase estacionaria mejorando la solución y o purificación del lipopéptido deseado a partir de las impurezas relacionadas.

La presente invención es útil en cromatografía analítica e incluso más valiosa para cromatografía preparativa (es decir, usar cromatografía como una técnica de purificación a gran escala). Específicamente, aminoácidos, ésteres de aminoácidos o aminas se pueden usar como modificadores de fase móvil en la purificación cromatográfica de lipopéptidos, por ejemplo la purificación de Pneumocandina B₀, que es el material de partida de producto natural (un producto de fermentación) usado para preparar acetato de Capsofungina (Cancidas®). La presente invención podría ser también útil en purificar el precursor de producto de fermentación para otros lipopéptidos, tales como Micafungina, Anidulafungina, Cilofungina y Daptimicina.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1

Cromatograma de HPLC preparativa de cromatografía en gel de sílice de Pneumocandina B₀ en bruto, donde la alimentación de la columna contiene una pequeña cantidad de prolina. Figura 1A. Primera ejecución de la columna. Figura 1B. Ejecución decimoctavo de la columna. Se ve resolución mejorada de impurezas análogas en la última ejecución debido a la adsorción de prolina a partir de la solución de alimentación en la columna.

Figura 2

Figura 2A. Representación del tiempo de retención de Pneumocandina B₀ después de inyectar solución que contiene prolina sobre la columna, mostrando tiempo de retención incrementada, que vuelve al tiempo de retención original, según la prolina se desadsorbe lentamente a partir de la columna. Figura 2B y 2C. Cromatograma de una ejecución típica justo antes (2B) y después (2C)) de inyectar prolina sobre la columna. (Escala analítica columna de sílice de YMC 5 µ usando acetato de etilo/metanol/agua 87/9/7 v/v/v).

Figura 3

Cromatogramas de HPLC en gel de sílice para Pneumocandina B₀ en bruto eluidos con la fase móvil: (3A) sin L-prolina, (3B) con L-prolina 0,26 mM añadida, y (3C) con L-prolina 0,65 mM añadida. Muestran tiempo de retención incrementado de Pneumocandina B₀ e incrementó solución a partir de niveles análogos de prolina añadidos. (El tiempo de retención de Pneumocandina B₀ es 22 minutos con L-prolina 0,65 mM).

Figura 4

Cromatograma de HPLC para Pneumocandina B₀ en bruto eluido usando acetato de etilo al 20% y acetato de etilo/metanol/agua 87/9/7 v/v/v al 80% como la fase móvil. Esta mezcla de fase móvil da como resultado tiempo de retención incrementado de Pneumocandina B₀ pero sin la resolución incrementada de sus análogos observados cuando se añade prolina a la fase móvil (véase Figura 3). (El tiempo de retención de Pneumocandina B₀ es de 23 minutos).

Figuras 5 a 11

Cromatogramas de HPLC en gel de sílice para Pneumocandina B₀ en bruto eluidos (A) sin modificador de fase móvil (control) y (B) con la adición de diversos aminoácidos a la fase móvil. Muestran que la adición de todos los aminoácidos tiene un efecto en retención de Pneumocandina B₀ y/o en su resolución de sus análogos. (Escala analítica columna de sílice de YMC 5 µ usando acetato...

1. Un procedimiento para purificar un lipopéptido usando un modificador de fase móvil en un sistema de cromatografía en fase normal para mejorar la selectividad y/o la productividad de la purificación, en el que el modificador de fase móvil está seleccionado de un grupo constituido por una amina, un aminoácido o un éster de aminoácido, el sistema de cromatografía en fase normal incluye una fase móvil y una fase estacionaria, la fase móvil es un sistema disolvente que comprende uno o más disolventes, la fase estacionaria está seleccionada de gel de sílice y alúmina, y la amina está seleccionada del grupo constituido por: metilamina, etilamina, diisopropilamina, dietilamina, etilmetilamina, trietilamina, propilamina, anilina y dimetilanilina.

2. El procedimiento según se expone en la reivindicación 1, en el que el lipopéptido es un precursor de producto de fermentación de caspofungina, micafungina, cilofungina, andulifungina y daptomicina.

3. El procedimiento según se expone en la reivindicación 2, en el que el lipopéptido es Pneumocandina B₀.

4. El procedimiento según se expone en cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que la fase móvil está seleccionada del grupo constituido por: metilamina, etilamina, diisopropilamina, dietilamina, dimetilamina, etilmetilamina, trietilamina, propilamina, anilina y dimetilanilina.

5. El procedimiento según se expone en cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que el modificador de fase móvil es un aminoácido o un éster de aminoácido.

6. El procedimiento según se expone en la reivindicación 5, en el que el modificador de fase móvil aminoácido o éster de aminoácido está seleccionado del grupo constituido por: L-aminoácidos, D-aminoácidos, ésteres de L-aminoácidos y ésteres de D-aminoácidos.

7. El procedimiento según se expone en la reivindicación 6, en el que el modificador de fase móvil aminoácido o éster de aminoácido está seleccionado de: L-prolina, D-prolina, trans-4-hidroxi-L-prolina, trans-4-hidroxi-D-prolina, glicina, L-treonina, D-treonina, L-lisina, D-lisina, L-metionina, D-metionina, D-valina, L-valina y ésteres de los aminoácidos L- y D- mencionados anteriormente.

8. El procedimiento según se expone en la reivindicación 7, en el que el modificador de fase móvil aminoácido está seleccionado de: L-prolina y D-prolina.

9. El procedimiento según la reivindicación 3, en el que la fase estacionaria es gel de sílice.

10. El procedimiento según se expone en la reivindicación 3, en el que la fase móvil es un sistema disolvente que comprende agua, metanol y acetato de etilo.