Una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína HPV58 L1 como se define en SEQ ID Nº:

2, comprendiendo la secuencia de ácido nucleico una secuencia de nucleótidos como se define en SEQ ID Nº:1

Expresión optimizada de HPV 58 L1 en levadura.

Campo de la invención

La presente invención se refiere, en general, a la prevención y/o el tratamiento de la infección por virus del papiloma humano (HPV). De modo más específico, la presente invención se refiere a polinucleótidos sintéticos que codifican la proteína HPV58 L1 y a vectores y huéspedes recombinantes que comprenden dichos nucleótidos. Se describen partículas similares a virus (VLP) del HPV58 producidas expresando el HPV 58 L1 o L1 + L2 recombinante en células de levadura así como un procedimiento para fabricar vacunas y composiciones farmacéuticas para prevenir y tratar infecciones por HPV.

Antecedentes de la invención

Existen más de 80 tipos del virus del papiloma humano (HPV), muchos de los cuales han sido asociados con una amplia variedad de fenotipos biológicos, desde verrugas proliferativas benignas hasta carcinomas malignos (para revisión, véase McMurray y col., Int J. Exp. Pathol. 82(1): 15-33 (2001). El HPV6 y el HPV11 son los tipos más comúnmente asociados con verrugas benignas, condiloma acuminado no maligno y/o displasia de la mucosa genital o respiratoria de grado bajo. El HPV16 y el HPV18 son los tipos de riesgo alto más frecuentemente asociados con carcinomas in situ o invasivos cervicales, vaginales, de la vulva y del canal anal. Más del 90% de los carcinamas cervicales están asociados con infecciones por HPV16, HPV18 o los tipos oncogénicos menos prevalentes HPV31, -33, -45, -52 y -58, (Sciffman y col., J. Natk. Cancer Inst. 85(12): 958-64 (1993)). La observación de que el ADN del HPV se detecta en más del 90% de los cánceres cervicales proporciona fuertes evidencias epidemiológicas de que los HPV causan el carcinoma cervical.

Los virus del papiloma son virus pequeños (50-60 nm), sin envoltura, ADN icosaédricos que codifican hasta ochenta genes tempranos y dos genes tardíos. Los marcos de lectura abierta (ORF) de los genomas víricos se designan E1 a E7, y L1 y L2, donde "E" denota temprano y "L" tardío. L1 y L2 codifican proteínas de la cápside vírica, mientra que los genes E están asociados con funciones tales como la replicación vírica y la transformación celular.

La proteína L1 es la proteína principal de la cápside y tiene un peso molecular de 55-60 kDa. La proteína L2 es la proteína secundaria de la cápside. Los datos inmunológicos sugieren que la mayor parte de la proteína L2 está en posición interna respecto a la proteína L1 en la cápside vírica. Tanto las proteínas L1 como las L2 se conservan altamente entre virus del papiloma diferentes.

La expresión de la proteína L1 o de una combinación de las proteínas L1 y L2 en levadura, células de insectos, células de mamíferos o bacterias conduce al autoensamblaje de partículas similares a virus (VLP) (para revisión, véase Schiller y Roden, en Papillomavirus Reviews: Current Research on Papillomaviruses; Lacey, ed. Leeds, Reino Unido: Leeds Medical Information, páginas 101-12 (1996)). Las VLP son morfológicamente similares a viriones auténticos y son capaces de inducir a valoraciones altas de anticuerpos de neutralización tras administración a animales o seres humanos. Debido a que las VLP no contienen el genoma vírico potencialmente oncogénico, representan una alternativa segura de uso de virus vivos en el desarrollo de vacunas de HPV (para revisión, véase Schiller y Hidesheim, J. Clin. Virol. 19: 67-74 (2000)). Por este motivo, se han identificado los genes L1 y L2 como dianas inmunológicas para el desarrollo de vacunas preventivas y terapéuticas para infecciones y enfermedades por HPV.

Tobery, T.W. y col. (2003) describen una comparación entre dos tipos de vacunas para inducir respuestas inmunológicas humorales específicas del HPV16L1: "...se inmunizaron macacos con un vector adenovírico (Ad) que codifica HPV16L1..., un vector de ADN plásmido que codifica HPV16L1..., HPV16L1 producido en levadura...o HPV16L1 producido en levadura + partículas quiméricas similares a virus E1/E2/E7..." (pág. 1541, columna lateral de la derecha, última párrafo). Se encontró que "el grupo VPL L1 tiene valoraciones de neutralización significantemente más altas que los grupos VLPc, ADN L1 y adeno L1..." (página 1542, columna lateral de la derecha, primer párrafo).

El desarrollo y la comercialización de la vacuna de HPV se han visto obstaculizados por dificultades asociadas con la obtención de altos niveles de expresión de las proteínas de la cápside en organismos huéspedes transformados satisfactoriamente, limitando la producción de proteína purificada. Por lo tanto, a pesar de la identificación de secuencias de nucleótidos de tipo silvestre que codifican proteínas HPV L1 tales como la proteína HPV58L1, sería muy deseable desarrollar una fuente fácilmente renovable de proteína HPV L1 bruta que utilice secuencias de nucleótido de codificación de HPV58 L1 que se optimicen por expresión en la célula huésped pretendida. Adicionalmente, sería útil producir grandes cantidades de VLP del HPV58 L1 que tengan la propiedades que confieren inmunidad de las proteínas nativas para su uso en el desarrollo de vacunas.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a composiciones y procedimientos para fabricar una vacuna sobre la base de productos proteicos expresados por genes HPV58 L1. La presente invención proporciona polinucleótidos que codifican la proteína HPV58 L1, habiéndose optimizado los codones de los polinucleótidos para la expresión a alto nivel en una célula de levadura. La presente invención proporciona además partículas similares a virus (VLP) del HPV58, produciéndose dichas VLP por expresión de HPV58 L1 o L1+L2 recombinante en células de levadura, y da a conocer el uso de VLP del HPV58 en composiciones farmacéuticas y vacunas para la prevención y/o tratamiento de cáncer asociado a HPV.

La presente invención se refiere a moléculas de ADN sintéticas que codifican la proteína HPV58 L1. Los codones de las moléculas sintéticas están diseñados de modo que se usen los codones preferentes por una célula de levadura. Las moléculas sintéticas pueden usarse como una fuente de proteína HPV58 L1, la cual puede autoensamblarse en VLP. Dichas VLP pueden usarse en una vacuna basada en VLP.

Específicamente, la presente invención comprende una molécula sintética de ácido nucleico que codifica la proteína HPV58 L1 como se establece en la SEQ ID Nº:2, comprendiendo dicha molécula de ácido nucleico unas secuencia de nucleótidos como se establece en la SEQ ID Nº:1 (denominada en el presente documento "secuencia 58 L1 R").

También proporciona vectores recombinantes y células huésped recombinantes, tanto procariotas como eucariotas, que contienen las moléculas de ácido nucleico reveladas a lo largo de la presente memoria descriptiva. En una realización preferente de la presente invención, la célula huésped es una célula de levadura.

Esta invención también se refiere a procedimientos para producir VLP del HPV58 y procedimientos para usar VLP del HPV58.

En una realización preferente de la presente invención, la levadura se selecciona del grupo constituido por: Saccharomyces cerevisiae, Hansenula polymorpha, Pichia pastoris, Kluyveromyces fragilis, Kluyveromyces lactis y Schizosaccharomyces pombe.

La presente invención se refiere también a un procedimiento de fabricación de una vacuna que comprende partículas similares a virus (VLP) del HPV58, en el que las VLP del HPV58 se producen en levadura.

En una realización alternativa de este aspecto de la invención, el procedimiento de fabricación de una vacuna comprende además la adición de VLP de al menos un tipo de HPV adicional. El al menos un tipo de HPV adicional puede ser cualquier tipo de HPV de interés, incluidos cualquier tipo de HPV descrito en la técnica o aquellos identificados subsecuentemente. En una realización preferente, el tipo de HPV es un tipo que está asociado con un fenotipo clínico tal como verrugas o cáncer cervical. En una realización preferente adicional, el al menos un tipo de HPV adicional se selecciona del grupo constituido por: HPV6, HPV11, HPV16, HPV18, HPV31, HPV33, HPV35, HPV39, HPV45, HPV51, HPV52, HPV55, HPV56, HPV59 y HPV68.

Tal como se usan a lo largo de la presente memoria descriptiva y reivindicaciones anexas, las formas singulares "un", "una", "el" y "la" incluyen la referencia plural a menos de que el contexto indique claramente lo contrario.

Tal como se usan a lo largo de la presente memoria descriptiva y reivindicaciones anexas,...

1. Una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína HPV58 L1 como se define en SEQ ID Nº:2, comprendiendo la secuencia de ácido nucleico una secuencia de nucleótidos como se define en SEQ ID Nº:1.

2. Un vector que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1.

3. Una célula huésped que comprende el vector de la reivindicación 2.

4. La célula huésped de la reivindicación 3, siendo la célula huésped una célula de levadura.

5. La célula huésped de la reivindicación 4, seleccionándose la célula de levadura del grupo constituido por Saccharomyces cerevisiae, Hansenula polymorpha, Pichia pastoris, Kluyveromyces fragilis, Kluyveromyces lactis y Schizosaccharomyces pombe.

6. La célula huésped de la reivindicación 5, siendo la célula huésped Saccharomyces cerevisiae.

7. Un procedimiento para producir partículas similares a virus (VLP) del HPV58 L1 que comprende:

8. El procedimiento de la reivindicación 7, en el que la levadura se selecciona del grupo constituido por Saccharomyces cerevisiae, Hansenula polymorpha, Pichia pastoris, Kluyveromyces fragilis, Kluyveromyces lactis y Schizosaccharomyces pombe.

9. El procedimiento de la reivindicación 8, en el que la levadura es Saccharomyces cerevisiae.

10. Un procedimiento para fabricar una vacuna para el tratamiento o la prevención de infecciones por HPV, comprendiendo dicho procedimiento la producción de VLP del HPV58 L1 por el procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 7-8.

11. El procedimiento de la reivindicación 10, en el que la vacuna comprende además VLP de al menos un tipo de HPV adicional.

12. El procedimiento de la reivindicación 11, en el que el al menos un tipo de HPV adicional se selecciona del grupo constituido por HPV6, HPV11, HPV16, HPV18, HPV31, HPV33, HPV35, HPV39, HPV45, HPV51, HPV52, HPV55, HPV56, HPV59 y HPV68.

13. El procedimiento de la reivindicación 12, en el que al menos un tipo de HPV comprende HPV 16.

14. El procedimiento de la reivindicación 13, en el que la vacuna comprende además VLP del HPV 18.

15. El procedimiento de la reivindicación 14, en el la vacuna comprende además VLP del HPV 6 y VLP del HPV 11.

16. El procedimiento de la reivindicación 14 ó 15, en el que la vacuna comprende además VLP del HPV 31.

17. El procedimiento de la reivindicación 16, en el que la vacuna comprende además VLP del HPV 45.