TOXINA MUTADA Y PEGILADA DE CLOSTRIDIUM BOTULINUM.
Toxina botulínica modificada que presenta una cadena pesada natural y una cadena ligera modificada,
caracterizada porque la modificación de la cadena ligera consiste en que
(a) (i) esta presenta en su extremo N un alargamiento de la cadena que tiene la estructura, -(C)n-(tag)m-(X)k-, en la dirección del extremo N al extremo C y (ii) al menos uno de los restos de cisteína en el alargamiento de la cadena está acoplado a al menos una cadena de PEG, o en que
(b) al menos un resto de aminoácido y como máximo 20 restos de aminoácido de los restos de aminoácido que se hallan naturalmente en su extremo N está/n mutado/s en un resto de cisteína, estando al menos uno de los, como máximo, 20 restos de cisteína en el extremo N acoplado a al menos una cadena de PEG y la cadena ligera, dado el caso, presenta adicionalmente un alargamiento N-terminal, de modo que la secuencia de la cadena ligera tiene la estructura -(tag)m-(X)k-BoNT(X1-20C), en la dirección del extremo N al extremo C,
en la que
C representa un resto de cisteína
tag representa una marca cualquiera y
X representa el resto de un aminácido cualquiera presente de manera natural;
en la que
n es un número entero de 1 a 50;
en la que
m = 0 o m = 1 y
k = 0 o k es un número entero de 1 a 50
Tipo: Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: W07002296EP.
Solicitante: BIOTECON THERAPEUTICS GMBH.
Nacionalidad solicitante: Alemania.
Dirección: HERMANNSWERDER HAUS 17,14473 POTSDAM.
Inventor/es: FREVERT, JURGEN, SPECHT,VOLKER.
Fecha de Publicación: .
Fecha Concesión Europea: 16 de Septiembre de 2009.
Clasificación Internacional de Patentes:
- C07K14/33 QUIMICA; METALURGIA. › C07 QUIMICA ORGANICA. › C07K PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas C07D; ipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina diones-2,5, C07D; alcaloides del cornezuelo del centeno de tipo péptido cíclico C07D 519/02; proteínas monocelulares, enzimas C12N; procedimientos de obtención de péptidos por ingeniería genética C12N 15/00). › C07K 14/00 Péptidos con más de 20 aminoácidos; Gastrinas; Somatostatinas; Melanotropinas; Sus derivados. › de Clostridium (G).
Clasificación PCT:
- A61K38/16 NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA. › A61 CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE. › A61K PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO (dispositivos o métodos especialmente concebidos para conferir a los productos farmacéuticos una forma física o de administración particular A61J 3/00; aspectos químicos o utilización de substancias químicas para, la desodorización del aire, la desinfección o la esterilización, vendas, apósitos, almohadillas absorbentes o de los artículos para su realización A61L; composiciones a base de jabón C11D). › A61K 38/00 Preparaciones medicinales que contienen péptidos (péptidos que contienen ciclos beta-lactama A61K 31/00; dipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina 2,5-dionas, A61K 31/00; péptidos basados en la ergolina A61K 31/48; que contienen compuestos macromoleculares que tienen unidades aminoácido repartidas estadísticamente A61K 31/74; preparaciones medicinales que contienen antígenos o anticuerpos A61K 39/00; preparaciones medicinales caracterizadas por los ingredientes no activos, p. ej. péptidos como soportes de fármacos, A61K 47/00). › Péptidos que tienen más de 20 aminoácidos; Gastrinas; Somatostatinas; Melanotropinas; Sus derivados.
- C07K14/33 C07K 14/00 […] › de Clostridium (G).
Fragmento de la descripción:
Toxina mutada y pegilada de Clostridium botulinum.
La presente invención se refiere a toxinas botulínicas (BoNT) modificadas que, en comparación con las correspondientes toxinas botulínicas nativas, presentan una mayor estabilidad y, por lo tanto, una duración prolongada del efecto terapéutico. La presente invención se refiere además a composiciones farmacéuticas que contienen estas toxinas botulínicas modificadas. Finalmente, la presente invención se refiere a ácidos nucleicos que codifican estas toxinas botulínicas modificadas.
Antecedentes de la invención
Clostridium botulinum es una bacteria formadora de esporas de crecimiento anaerobio, que forma una proteína de alta toxicidad. Esta, así denominada, toxina botulínica es la causa del botulismo, una intoxicación alimentaria que, sin la aplicación de medidas médicas intensivas, puede conducir a la muerte del paciente de botulismo. Se distinguen siete serotipos (tipos A-G, abreviados como BoNT/A, BoNT/B, etc.), que tienen una secuencia de aminoácidos similar pero inducen una respuesta de anticuerpos diferente. Las toxinas (denominadas también neurotoxinas y toxinas botulínicas en lo sucesivo) constan de dos cadenas funcionales, la cadena ligera (~50 kDa) y la cadena pesada (~100 kDa), que en algunas cepas de clostridios se producen por escisión proteolítica de la proteína precursora de una sola cadena. Otras cepas no disponen de la correspondiente proteasa y, por lo tanto, la escisión en las dos cadenas tiene lugar solamente en el tracto gastrointestinal del paciente (por ejemplo, mediante tripsina). En la forma de dos cadenas, las dos subunidades (es decir, las cadenas pesada y ligera) están unidas mediante un puente disulfuro (además, en BoNT/A, por ejemplo, hay un puente disulfuro intramolecular, es decir, entre dos restos de cisteína de la cadena pesada).
Las neurotoxinas puras no se hallan libres en condiciones ácidas in vivo, sino que forman complejos con otras proteinas clostrídicas, los así denominados complejos de toxinas (Clostridium botulinum). En estos complejos participan distintas proteínas, por ejemplo, con propiedades hemoaglutinantes. La composición de los complejos es diferente entre serotipos. La integración en un complejo protege la neurotoxina a su paso por el tracto gastrointestinal. Posiblemente, estas otras proteínas clostrídicas (las proteínas complejantes o bien las proteínas del complejo) desempeñan también un papel en la resorción de la neurotoxina. Así, la incorporación en el complejo consigue que la neurotoxina sea biodisponible por vía oral y por lo tanto sea una toxina alimentaria. El sitio de acción de la neurotoxina se halla en la placa motora terminal, donde el nervio activa el músculo. La motoneurona segrega acetilcolina para la activación del músculo. La toxina botulínica impide esta segregación. El efecto inhibidor de la neurotoxina se lleva a cabo en tres etapas secuenciales: unión, translocación, proteolisis. La cadena pesada de la toxina botulínica se une a la motoneurona con gran especificidad y a continuación es absorbida por la célula nerviosa en endosomas. El dominio de translocación se encuentra en la región N-terminal de la cadena pesada, delante del dominio de unión que se encuentra localizado en el extremo C de la cadena pesada, y transporta o bien hace posible la translocación de la cadena ligera en el citosol de la célula nerviosa por un mecanismo que no se conoce exactamente hasta ahora. La cadena ligera se activa como proteasa en el citosol, escindiendo de manera muy específica las proteínas denominadas SNARE. La especificidad proteolítica de cada tipo de toxina botulínica se resume en la tabla 1. Estas proteínas SNARE son responsables de la fusión de las vesículas secretoras cargadas con acetilcolina con la membrana celular de la motoneurona. La escisión proteolítica de una de estas proteínas SNARE impide la formación de un complejo de fusión y, por tanto, la segregación posterior de acetilcolina. El músculo afectado ya no se activa. Los músculos previamente hiperactivos se paralizan.
Este mecanismo de acción se aprovecha en la terapia de numerosas distonías o bien espasmos que se caracterizan por una segregación incontrolada de acetilcolina (por ejemplo, blefaroespasmo, tortícolis, espasticidad). Para la terapia de la distonía se inyectan cantidades extremadamente bajas de la neurotoxina (en el intervalo de pg hasta ng) en los músculos hiperactivos. La neurotoxina se difunde hasta la placa motora terminal y alcanza el citosol de la neurona para impedir allí la secreción de la acetilcolina. Después de 1-2 días el músculo queda paralizado.
Diversas arrugas faciales se producen por el agarrotamiento de músculos que se encuentran bajo la piel, es decir, asimismo por una secreción irregular de acetilcolina. Aquí es donde las toxinas botulínicas tienen su aplicación cosmética: mediante la inyección de cantidades extremadamente pequeñas de la toxina botulínica pueden eliminarse las arrugas durante 3 meses, aproximadamente.
En la actualidad hay cuatro preparados que contienen la toxina botulínica autorizados legalmente como medicamentos: Botox® (Allergan), Xeomin® (Merz), Dysport® (Ipsen) y NeuroBloc® (Solstice Neurosciences). Botox®, Xeomin® y Dysport® son liofilizados de la toxina botulínica de tipo A (como complejo, neurotoxina o bien complejo), Botox® y Xeomin®, con 100 unidades por vial de inyección, respectivamente, Dysport® con 500 unidades. NeuroBloc® contiene la toxina botulínica de tipo B (como complejo) con 5.000 o bien 10.000 unidades en una formulación líquida.
Con la excepción de NeuroBloc, los preparados se presentan como liofilizados, que se reconstituyen con disolución salina y se inyectan en los músculos afectados en las dosis adecuadas según el preparado y la indicación. El músculo tratado se paraliza en el plazo de 48 h. El efecto dura 3 meses, aproximadamente, después debe realizarse otra inyección en caso de que el músculo deba continuar paralizado, es decir, deba seguir tratándose la distonía. Hasta ahora no se ha aclarado definitivamente qué procesos controlan la disminución del efecto. Mientras la cadena ligera esta activa como proteasa, se escinde la proteína SNARE correspondiente (por ejemplo SNAP 25 por la cadena ligera de la neurotoxina de tipo A). Como consecuencia, en estas condiciones se impide la fusión de las vesículas setretoras con la membrana plasmática y, por lo tanto, la secreción de acetilcolina, el músculo permanece paralizado. Si se consiguiera mantener la actividad proteasa de la cadena ligera en la célula por un tiempo prolongado, también se prolongaría de este modo la duración del efecto de un medicamento correspondiente.
A diferencia de muchos principios activos de bajo peso molecular, los principios activos proteínicos se caracterizan por una estabilidad considerablemente inferior. La semivida de algunos principios activos proteínicos en la circulación sanguínea es, por ejemplo, de solo unos pocos minutos, de modo que la duración del efecto (terapéutico) es muy limitada y es necesario inyectar de nuevo a cortos intervalos de tiempo. La semivida puede prolongarse si se consigue proteger la proteína contra los procesos de degradación y eliminación. Un modo teóricamente posible, en particular para proteínas eucarióticas, consiste en una mayor glicosilación (más restos de hidratos de carbono) o bien en adaptar las estructuras de hidratos de carbono a las estructuras de las glicoproteínas humanas. Otro modo, que ha sido aplicado para una serie de principios activos autorizados, consiste en enlazar la proteína con polietilenglicol (PEG). El PEG puede unirse covalentemente a los restos de distintos aminoácidos, por ejemplo, a restos de lisina (función amino) o de cisteína (función SH). El PEG incrementa el peso molecular de la proteína sin que se generen estructuras inmunogénicas que induzcan la formación de anticuerpos contra el principio activo. Por el contrario: la PEGilación reduce la inmunogenicidad del principio activo. Debido al aumento del peso molecular, la proteína se elimina más lentamente y se consigue un claro aumento de la semivida en el suero. El medicamento debe inyectarse con menor frecuencia para mantener un determinado nivel requerido en el suero.
Los principios activos proteínicos PEGilados se procesan ya para obtener algunos medicamentos autorizados (véase la tabla 2). El empleo de, en parte, proteínas pequeñas (por ejemplo, interferón a 2a: Mr = 19,3 kDa) en la forma nativa,...
Reivindicaciones:
1. Toxina botulínica modificada que presenta una cadena pesada natural y una cadena ligera modificada, caracterizada porque la modificación de la cadena ligera consiste en que
(a) (i) esta presenta en su extremo N un alargamiento de la cadena que tiene la estructura, -(C)n-(tag)m-(X)k-, en la dirección del extremo N al extremo C y (ii) al menos uno de los restos de cisteína en el alargamiento de la cadena está acoplado a al menos una cadena de PEG, o en que
(b) al menos un resto de aminoácido y como máximo 20 restos de aminoácido de los restos de aminoácido que se hallan naturalmente en su extremo N está/n mutado/s en un resto de cisteína, estando al menos uno de los, como máximo, 20 restos de cisteína en el extremo N acoplado a al menos una cadena de PEG y la cadena ligera, dado el caso, presenta adicionalmente un alargamiento N-terminal, de modo que la secuencia de la cadena ligera tiene la estructura -(tag)m-(X)k-BoNT(X1-20C), en la dirección del extremo N al extremo C,
en la que
C representa un resto de cisteína
tag representa una marca cualquiera y
X representa el resto de un aminácido cualquiera presente de manera natural;
en la que
n es un número entero de 1 a 50;
en la que
m = 0 o m = 1 y
k = 0 o k es un número entero de 1 a 50.
2. La toxina botulínica según la reivindicación 1, caracterizada porque ninguno de los restos de cisteína presentes de manera natural en las cadenas pesada y ligera de la toxina botulínica está PEGilado.
3. La toxina botulínica según las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizada porque la marca es una marca His o una marca Strep.
4. La toxina botulínica según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque la toxina botulínica es una toxina botulínica de los tipos A, B, C1, D, E, F o G y se cumple una de las condiciones siguientes:
(a) n = 1, 2 ó 3, m = 0 ó 1, k = 0 o k
(b1) n = 1, m = 1, k = 0; (b2) n = 2, m = 1, k = 0 ; (b3) n = 3, m = 1, k = 0;
(c1) n = 1, m = 0, k = 0; (c2) n = 2, m = 0, k = 0; (c3) n = 3, m = 0, k = 0;
(d1) n = 1, m = 1, k
(e1) n = 1, m = 0, k
estando la toxina acoplada a una, a dos o a tres moléculas de PEG por molécula, dependiendo de que n = 1, 2 ó 3.
5. La toxina botulínica según una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque el alargamiento de la cadena ligera tiene una de las secuencias siguientes:
-(C)1-(tag)1-(X)0-, -(C)2-(tag)1-(X)0-, -(C)3-(tag)1-(X)0-, -(C)4-(tag)1-(X)0-, -(C)5-(tag)1-(X)0-, -(C)1-(tag)1-(X)1-, -(C)2-(tag)1-(X)1-, -(C)3-(tag)1-(X)1-, -(C)4-(tag)1-(X)1-, -(C)5-(tag)1-(X)1-, -(C)1-(tag)1-(X)2-, -(C)2-(tag)1-(X)2-, -(C)3-(tag)1-(X)2-, -(C)4-(tag)1-(X)2-, -(C)5-(tag)1-(X)2-, -(C)1-(tag)1-(X)3-, -(C)2-(tag)1-(X)3-, -(C)3-(tag)1-(X)3-, -(C)4-(tag)1-(X)3-, -(C)5-(tag)1-(X)3-, -(C)1-(tag)1-(X)4-, -(C)2-(tag)1-(X)4-, -(C)3-(tag)1-(X)4-, -(C)4-(tag)1-(X)4-, -(C)5-(tag)1-(X)4-,
en las que para cada una de estas 25 secuencias m también puede ser 0 y/o, en cada caso, todos los restos de cisteína presentes en el alargamiento de la cadena ligera también están PEGilados.
6. La toxina botulínica según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque la toxina botulínica es una toxina botulínica de los tipos A, B, C1, D, E, F o G y se cumple una de las condiciones siguientes:
(a) m = 1, k = 0, solo uno de los 20 restos de aminoácido N-terminales está sustituido por un resto de cisteína, en particular solo el resto en la posición 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10;
(b) m = 0, k = 0, solo uno de los 20 restos de aminoácido N-terminales está sustituido por un resto de cisteína, en particular solo el resto en la posición 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10;
(c) m = 1, k
(d) m = 0, k
(e) m = 1, k = 0, solo dos de los 20 restos de aminoácido N-terminales están sustituidos por un resto de cisteína, en particular solo los restos en las posiciones 1 y 3, 1 y 4, 2 y 4, 1 y 5, 2 y 5, 3 y 5, 1 y 6, 2 y 6, 3 y 6 ó 4 y 6;
(f) m = 0, k = 0, solo dos de los 20 restos de aminoácido N-terminales están sustituidos por un resto de cisteína, en particular solo los restos en las posiciones 1 y 3, 1 y 4, 2 y 4, 1 y 5, 2 y 5, 3 y 5, 1 y 6, 2 y 6, 3 y 6 ó 4 y 6;
(g) m = 1, k
(h) m = 0, k
(i) m = 1, k = 0, solo dos de los 20 restos de aminoácido N-terminales están sustituidos por un resto de cisteína, en particular solo los restos en las posiciones 1 y 2, 2 y 3, 3 y 4, 4 y 5 ó 5 y 6;
(j) m = 0, k = 0, solo dos de los 20 restos de aminoácido N-terminales están sustituidos por un resto de cisteína, en particular solo los restos en las posiciones 1 y 2, 2 y 3, 3 y 4, 4 y 5 ó 5 y 6;
(k) m = 1, k
(l) m = 0, k
estando las toxinas acopladas a una o dos moléculas de PEG por molécula, dependiendo de que se hayan incorporado solo uno o dos restos de cisteína en el extremo N.
7. La toxina botulínica según una de las reivindicaciones 1 a 3 y 6, caracterizada porque la toxina botulínica modificada es una toxina botulínica cuya cadena ligera está modificada de tal modo que presenta un alargamiento de la cadena en su extremo N, presentando el extremo N de la cadena alargada una de las secuencias siguientes:
(a) -(tag)1-(X)0-BoNT(P1C), -(tag)1-(X)0-BoNT(F2C), -(tag)1-(X)0-BoNT(V3C), -(tag)1-(X)0-BoNT(N4C), -(tag)1-(X)0-BoNT(K5C),
(b) -(tag)1-(X)1-BoNT(P1C), -(tag)1-(X)1-BoNT(F2C), -(tag)1-(X)1-BoNT(V3C), -(tag)1-(X)1-BoNT(N4C), -(tag)1-(X)1-BoNT(K5C),
(c) -(tag)1-(X)2-BoNT(P1C), -(tag)1-(X)2-BoNT(F2C), -(tag)1-(X)2-BoNT(V3C), -(tag)1-(X)2-BoNT(N4C), -(tag)1-(X)2-BoNT(K5C),
(d) -(tag)1-(X)3-BoNT(P1C), -(tag)1-(X)3-BoNT(F2C), -(tag)1-(X)3-BoNT(V3C), -(tag)1-(X)3-BoNT(N4C), -(tag)1-(X)3-BoNT(K5C),
(e) -(tag)1-(X)4-BoNT(P1C), -(tag)1-(X)4-BoNT(F2C), -(tag)1-(X)4-BoNT(V3C), -(tag)1-(X)4-BoNT(N4C), -(tag)1-(X)4-BoNT(K5C),
en las que para cada una de las 25 formas de realización preferidas listadas anteriormente (tag)1 puede ser también (tag)0 y/o, en cada caso, todos los restos de cisteína incorporados en el extremo N también están PEGilados.
8. La toxina botulínica según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque la toxina botulínica es una toxina botulínica de los tipos A, B o C1.
9. La toxina botulínica según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque la toxina botulínica modificada presenta al menos el 20%, preferentemente el 30-40%, el 50-70% o el 75-95% de la actividad biológica de la toxina botulínica natural (sin modificar, nativa) correspondiente y una mayor estabilidad en comparación con esta.
10. La toxina botulínica según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque la cadena ligera modificada se transloca in vivo en el citosol de las motoneuronas.
11. La toxina botulínica según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque la cadena ligera modificada presenta una estabilidad en el citosol de las motoneuronas mayor que la de la toxina botulínica nativa correspondiente.
12. Composición farmacéutica, comprendiendo la composición la toxina botulínica modificada según una de las reivindicaciones precedentes.
13. La composición farmacéutica según la reivindicación 12, composición que se estabiliza sin la adición de albúmina de suero humano (HSA).
14. La composición farmacéutica según las reivindicaciones 12 ó 13, la composición que se halla en forma liofilizada o líquida y siendo las dos formas, dado el caso después de su disolución en un disolvente adecuado, adecuadas para la inyección intramuscular.
15. La composición farmacéutica según la reivindicación 12, estando prevista la composición para su uso en la terapia de distonías, así como en la eliminación de arrugas faciales.
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