SISTEMA DE PRUEBA PARA DETECTAR SALMONELA.

Sistema de prueba para la detección de infecciones por salmonela existentes actualmente y/o en el pasado en una muestra,

caracterizado porque el sistema de prueba comprende por lo menos un anticuerpo monoclonal que reacciona específicamente con la proteína SipC de salmonela y que se produce (a) a partir de las células del cultivo de células de hibridoma depositado en la DSMZ-Colección alemana de microorganismos y cultivos celulares GmbH, Alemania, el 1 de junio de 2006 con el número DSM ACC2790 con el código de laboratorio I5B2, o (b) a partir de las células del cultivo de células de hibridoma depositado en la DSMZ-Colección alemana de microorganismos y cultivos celulares GmbH, Alemania, el 1 de junio de 2006 con el número DSM ACC2789 con el código de laboratorio V1H7

Sistema de prueba para detectar salmonela.

La invención se refiere a un sistema de prueba para detectar infecciones por salmonela en una muestra.

Las salmonelas son bacterias con forma de bastoncillo gram-negativas móviles. La diferencia taxonómica de las salmonelas se realiza mediante su antígeno de cuerpo (O) y flagelo (H) según el esquema de Kauffmann-White (una tabla de antígenos diagnóstica) y resulta en un sistema de clasificación en el que las salmonelas se declaran de serovariedades y se caracterizan y clasifican por una serofórmula. De las más 2400 serovariedades de salmonela conocidas hasta la fecha, en la práctica hasta la fecha sólo de veinte a treinta tienen importancia como patógenos de enfermedades epidemiológicas. A éstos pertenecen los patógenos del tifus (S. typhi) y paratifus (S. paratyphi A, S. paratyphi B, S. paratyphi C) y un gran número de patógenos de enteritis, las denominadas "salmonelas de enteritis". Mientras que la salmonela del tifus y del paratifus causa infecciones generales generalizadas graves, es decir, infecciones de todo el cuerpo, la infección por salmonela de enteritis se limita generalmente localmente al intestino.

Las salmonelosis del ser humano son la mayoría de las veces enfermedades debidas a los alimentos. La infección se realiza generalmente por el consumo de alimentos infectados o contaminados, por lo que el contagio a los seres humanos sólo se realiza raramente por el contacto directo con animales que excretan la salmonela. Un contagio directo o indirecto de ser humano a ser humano puede realizarse como infección hospitalaria en personas especialmente predispuestas o en condiciones higiénicamente desfavorables.

Las fuentes de infección primarias son especialmente los alimentos procedentes de aves, ganado bovino y cerdo, incluso enfermando los animales en los casos más raros.

Por lo tanto, la detección de patógenos o anticuerpos no sólo tiene importancia decisiva en la medicina, sino también en la veterinaria y en industrias alimentarias. La dosis de infección para los seres humanos adultos se encuentra en 10⁴ a 10⁶ gérmenes. El tiempo de incubación asciende a 5-72 h y depende de la cantidad de dosis de infección.

En el caso de una infección por salmonela de enteritis, la denominada salmonelosis de enteritis, la infección se manifiesta inicialmente con diarrea, náuseas o vómitos y fiebre moderada. Los síntomas duran generalmente sólo algunas horas o días. Sin embargo, en el caso hbox{de pacientes debilitados, esta enfermedad también puede llevar a la muerte.}

La excreción de los gérmenes de la salmonela de enteritis dura como media de tres a seis semanas, pero en lactantes también durante meses.

En el caso de pacientes con antecedentes hereditarios, la salmonela puede desencadenar como enfermedad secundaria una artritis reactiva 2-6 semanas después de la infección enterítica que en casos raros adopta una forma progresiva crónica. Como en este momento la mayoría de las veces no puede detectarse o criarse ningún patógeno más, los procedimientos serológicos para la detección de una infección por salmonela transcurrida en los últimos tiempos (= existente en el pasado) tienen una gran importancia (aglutinación de Widal; véase más adelante).

Según la ley de protección contra enfermedades infecciosas, la sospecha de o la enfermedad de gastroenteritis infecciosa aguda está sujeta bajo ciertas circunstancias a comunicación obligatoria, al igual que cualquier detección de salmonela. Además, en Alemania y otros países de la UE distintas disposiciones legales se ocupan de las medidas para el combate de la salmonela (por ejemplo: decreto sobre la salmonela en ganado bovino, decreto sobre la salmonela en pollos, distintas disposiciones de la legislación en materia de piensos y alimentos). Además, en el marco de los controles internos industriales se han establecido distintos programas de monitorización de la salmonela.

El centro de gravedad del diagnóstico del laboratorio clínico de la salmonelosis está en el cultivo de gérmenes de muestras de excrementos y su clasificación como casos sospechosos de salmonela con ayuda de sueros de búsqueda de salmonela omni o polivalentes. Generalmente, un diagnóstico de sospecha tal sólo puede hacerse aproximadamente de uno a dos días después de la recepción de la muestra en el laboratorio de diagnóstico. Para afirmar con certeza que existe una infección por salmonela, normalmente se necesitan otros 2-3 días. En este tiempo se caracterizan bioquímicamente (serie variada) y serológicamente clones individuales sospechosos. Para la diferenciación serológica se investigan los antígenos O y H en forma de una aglutinación en portaobjetos (esquema de Kaufmann-White). Para esto, inicialmente se usan sueros de prueba de salmonela polivalentes para a continuación determinar la fórmula de antígenos exacta con antisueros O o H monovalentes. Por tanto, para la detección definitiva de una infección por salmonela generalmente se necesitan en total 3-5 días. Especialmente en el caso de salmonelosis que fueron causadas por alimentos contaminados, el largo espacio de tiempo hasta el diagnóstico representa un gran problema porque entretanto pueden infectarse más personas. Por tanto, en el caso de una sospecha por salmonela es importante localizar la fuente de infección y así evitar la posterior propagación. Al mismo tiempo se aíslan adicionalmente los pacientes para evitar el contagio de la hbox{infección. Para el éxito de esta medida es de gran importancia una opinión de diagnóstico temprana.}

La detección serológica de anticuerpos contra salmonela desempeña una gran función en forma de sistemas de ELISA, sobre todo en la veterinaria y la industria alimentaria. Así, por ejemplo, en Alemania como también en los países limítrofes actualmente se determina sobre todo el estado de los anticuerpos de salmonela (predominantemente inmunoglobulina anti-LPS) de poblaciones animales. La detección se realiza a partir de/en jugo de carne o sangre. No obstante, este procedimiento presenta limitaciones ya que no todas las serovariedades de salmonela patógenas pueden detectarse eficazmente.

Por el contrario, en la medicina, especialmente en infecciones por salmonela tifosa, se utiliza la llamada prueba de aglutinación de Widal como complemento a la detección bacteriológica de patógenos. A este respecto, el suero del paciente se mezcla con suspensiones de salmonela hervidas (aglutinación del antígeno O) o formalinizadas (aglutinación del antígeno H) y se investigan para una aglutinación de las bacterias. En este caso es desventajoso, por una parte, el hecho de que no todas las infecciones van acompañadas de la formación de un título de antígeno anti-O, por otra parte, el hecho de que los anticuerpos contra los antígenos H puedan persistir durante años después de la infección. Por el contrario, los títulos contra los antígenos O descienden de nuevo la mayoría de las veces después de algunas semanas. Por lo tanto, no puede diferenciarse de forma fiable entre una infección aguda o ya superada.

En condiciones de cultivo in vitro, la salmonela emite al medio circundante distintas proteínas. Una de estas proteínas es la proteína SipC.

La secuencia de nucleótidos del gen de SipC es conocida y está a disposición para el experto mediante los bancos de datos de genes (por ejemplo, nº de registro: U25631 o X82670).

Por el documento WO 03/000935 se conoce el uso de cebadores de PCR y sondas de hibridación de FRET contra el gen de SipC para detectar salmonela. En este documento no se aborda la utilización de la proteína SicC para el mismo fin, especialmente la utilización de anticuerpos contra la proteína SipC.

Por el documento Weinrauch y col. "Neutrophil elastase targets virulence factors of enterobacteria" (Nature 2002, 417, 6884, 91-4) y Hayward y col. "Direct nucleation and bunbdling of actin by the SipC protein of invasive Salmonella" (EMBO J. 1999, 18, 18, 4926-34) se describe el uso de un anticuerpo policlonal contra la proteína SipC para su detección en inmunotransferencia.

Sin embargo, los anticuerpos policlonales descritos no son monoespecíficos para salmonela y, por tanto, no son adecuados para una detección específica de salmonela como se necesita sobre todo en el diagnóstico humano y el ensayo de alimentos.

En el documento WO 97/18225 A se describe la secuencia de nucleótidos de los genes de Ssp (=Sip) SipA, SipB, SipC y SipD y la secuencia de aminoácidos...

1. Sistema de prueba para la detección de infecciones por salmonela existentes actualmente y/o en el pasado en una muestra, caracterizado porque el sistema de prueba comprende por lo menos un anticuerpo monoclonal que reacciona específicamente con la proteína SipC de salmonela y que se produce (a) a partir de las células del cultivo de células de hibridoma depositado en la DSMZ-Colección alemana de microorganismos y cultivos celulares GmbH, Alemania, el 1 de junio de 2006 con el número DSM ACC2790 con el código de laboratorio I5B2, o (b) a partir de las células del cultivo de células de hibridoma depositado en la DSMZ-Colección alemana de microorganismos y cultivos celulares GmbH, Alemania, el 1 de junio de 2006 con el número DSM ACC2789 con el código de laboratorio V1H7.

2. Sistema de prueba según la reivindicación 1, caracterizado porque el sistema de prueba es un ELISA.