Método para producir partículas infecciosas del virus de la hepatitis C (HCV),

que comprende la etapa de introducir el siguiente vector de expresión i) o ii) en una célula que se selecciona del grupo que comprende Huh7, HepG2 y células de líneas celulares derivadas de las mismas:

i) un vector de expresión que comprende: secuencias de ADN que codifican la región 5'' no traducida, la proteína Core, la proteína E1, la proteína e2, la proteína p7 y la proteína NS2 derivadas de una cepa de HCV y secuencias de ADN que codifican las proteínas NS3, NS4A, NS4B, NS5A y NS5B y la región 3'' no traducida derivada de la cepa JFH1 del HCV, en dirección 3'' con respecto al promotor de la polimerasa I; y ADN que comprende un terminador de la ARN polimerasa I, también en dirección 3'' del mismo; o

ii) un vector de expresión que comprende: secuencias de ADN que codifican la región 5'' no traducida, la proteína Core, la proteína E1, la proteína E2 y la proteína p7 derivadas de una cepa de HCV y secuencias de ADN que codifican las proteínas NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A y NS5B y la región 3'' no traducida derivada de la cepa JFH1 del HCV, en dirección 3'' con respecto al promotor de la ARN polimerasa I; y ADN que contiene un terminador de la ARN polimerasa I, también en dirección 3'' del mismo

Sistema de producción elevada de partículas infecciosas del virus de la hepatitis C.

Sector de la invención

La presente invención se refiere a un método de producción elevada de partículas infecciosas del virus de la hepatitis C humano.

Técnica anterior

El virus de la hepatitis C humano (HCV) es un virus de ARN de cadena simple que provoca una hepatitis crónica a través de una infección persistente. Actualmente, la principal causa de la hepatitis crónica observada mundialmente es la infección por HCV persistente. De hecho, alrededor del 50% de los pacientes con una infección persistente desarrollan hepatitis crónica. La hepatitis crónica en aproximadamente el 20% de estos pacientes evoluciona a una cirrosis hepática durante el transcurso de 10 a 20 años, y algunos de estos pacientes evolucionan posteriormente a unas condiciones patológicas letales avanzadas, tales como el cáncer hepático.

Las principales razones por las que se dificultan los estudios sobre el desarrollo de terapias para dichas enfermedades serias son la falta de sistemas de cultivos celulares eficaces para la proliferación del HCV, la falta de modelos de animales pequeños apropiados susceptibles de la infección por HCV, la replicación viral a niveles bajos, y la heterogeneicidad genética en genomas virales.

De este modo, se ha esperado que el desarrollo de sistemas de replicación del genoma del HCV en sistemas de cultivo celular contribuya al entendimiento de la replicación viral y la interacción virus-célula y la disposición de sistemas para la evaluación de fármacos terapéuticos para enfermedades inducidas por HCV.

Recientemente, se han producido replicones de ARN subgenómico del HCV como ARN replicables de manera autónoma derivados de HCV (documentos 1 y 2 de patentes y los documentos 1-3 que no son patentes). De este modo, es posible analizar el mecanismo de replicación del HCV con la utilización de células de cultivo. Dichos replicones de ARN subgenómico del HCV se obtienen mediante la sustitución de proteínas estructurales localizadas en dirección 3' del IRES del HCV en la región 5' no traducida del ARN genómico del HCV con un gen resistente a neomicina y EMCV-IRES unido en dirección 3' del mismo. Mediante la introducción de dicho replicón de ARN en una célula cancerosa de hígado humano Huh7 y el cultivo de la célula en presencia de neomicina, se demostró que el replicón de ARN se replica de manera autónoma en células Huh7. Sin embargo, sólo se puede evaluar en este sistema experimental la replicación de ARN viral, entre los procesos de propagación y replicación del virus HCV, y, de este modo, las partículas virales no se producen en el mismo. De este modo, los procesos de la formación de partículas del virus HCV en células infectadas, la liberación extracelular de partículas del HCV y la infección de otra célula con las mismas no se pueden analizar en el sistema.

A efectos de resolver el problema anterior, se ha dado a conocer un método para producir partículas de virus en un sistema de células de cultivo. El sistema utiliza ADNc del ARN genómico completo del HCV sin la utilización de un replicón de ARN.

Lim y otros intentaron producir partículas de virus HCV mediante el tratamiento con tetraciclina de una línea celular obtenida mediante la introducción de un vector de expresión en el que el ADNc de ARN genómico de la cepa HCV-S1 (genotipo 1b) se une en dirección 3' con respecto a un promotor de respuesta a tetraciclina en una célula Huh7. Confirmaron la presencia de partículas del HCV a razón de 1 a 6 x 10⁵ copias/ml en el sobrenadante de cultivo. Sin embargo, dieron a conocer que dichas partículas del HCV presentan una capacidad de infección baja (documento 4 que no es patente).

Sin embargo, cuando el ADNc del HCV se expresa bajo el control de un promotor del tipo ARN polimerasa II, tal como CMV, se añaden una estructura CAP ("caperuza") y una cadena de poliA al extremo 5' y al extremo 3' del ARN transcrito, respectivamente. Por consiguiente, dicho ARN se utiliza como molde para la síntesis de proteínas en un ribosoma, de manera que no tiene lugar la replicación del ARN transcrito, lo cual es problemático.

A efectos de resolver el problema anterior, Heller y otros prepararon una construcción que puede causar la síntesis intracelular del ARN de HCV al que no se añade una estructura cap o poliA, mediante la unión de una secuencia de ribozima al extremo 5' y al extremo 3' del genoma de HCV, de manera que se transcribe intracelularmente con ARN polimerasa II y después de lo cual el transcrito es dividido con el ribozima para producir dicho ARN del HCV (documento 5 que no es patente). Dicho método para evitar la adición de una estructura cap en el extremo 5' mediante un ribozima se utiliza en un método para la síntesis intracelular del ARN de tipo horquilla (documento 6 que no es patente). En la práctica, se ha observado que las partículas de HCV se producen a razón de 1 x 10⁷ copias/ml cuando se expresa en Huh7 un vector de expresión que tiene una construcción HCV situada entre dos ribozimas. Cabe indicar que no se ha examinado si dichas partículas muestran o no capacidad de infección.

Además, se ha observado recientemente que las partículas de HCV que tienen la capacidad de infectar células se pueden producir a partir del ARN genómico completo del HCV en un sistema de cultivo celular (documento 3 de patente y documentos 7 y 8 que no son patentes). En dicho sistema, la cantidad de producción de partículas de HCV es de aproximadamente 1 x 10⁷ copias/ml. Además, se ha observado que es posible producir partículas de HCV que tienen la capacidad de infectar células en un sistema de cultivo celular con la utilización de ARN viral quimérico en el que la región de proteínas no estructurales de la cepa con1 de HCV (genotipo 1b) se ha sustituido por el gen de una cepa viral (genotipo 2a) (documento 9 que no es patente). No se ha dado a conocer ningún valor específico para la cantidad de producción de partículas de HCV con la utilización de dicho sistema.

En base a los resultados anteriores, ha sido posible producir un sistema experimental que permite la evaluación del proceso que implica la formación de partículas del virus HCV en células infectadas, la liberación extracelular de partículas de HCV y la infección de otra célula con las mismas.

Sin embargo, la productividad del sistema establecido por Lim y otros es baja. Además, la capacidad de infección posible con el sistema establecido por Heller y otros no está clara. De este modo, se considera que podrían aparecer mutaciones después de la replicación del ARN en un sistema que utiliza ARN genómico completo del HCV. Se ha conocido que la replicación podría no tener lugar cuando aparecen mutaciones en el genoma del HCV. De hecho, se ha observado que dichas replicaciones no tienen lugar cuando aparece una mutación de la secuencia de aminoácidos GDD en la proteína NS5B, una proteína no estructural de HCV, a GND. Mientras tanto, la cantidad de producción de partículas de HCV es aproximadamente de 1 x 10⁷ copias/ml en ambos casos. De este modo, se espera un incremento adicional de la cantidad de producción.

Con respecto a un método para incrementar la cantidad de producción de partículas del virus HCV, se ha examinado la producción de una célula que produce un replicón a un nivel elevado. En este caso, se utilizó la célula Huh7 derivada de hígado humano para la replicación del virus HCV y se clonaron algunas células derivadas de la cepa. Entre éstas, se observó que las células referidas como Huh7.5 se replicaban aproximadamente 3 veces los replicones de ARN de HCV en la cepa parental. (Documento 10 que no es patente).

Bajo las circunstancias anteriores, se cree que es importante desarrollar un sistema de producción elevada para partículas de HCV infecciosas con la utilización de ADNc de ARN genómico completo de HCV.

Como sistema de producción de partículas de virus que utiliza ADNc correspondiente a ARN genómico de un virus de ARN, también se conoce un sistema que utiliza un promotor/terminador de la ARN polimerasa I, que se utiliza para la producción del virus de la gripe (virus de ARN de cadena negativa) en un sistema celular animal (documento 11 que no es patente). Sin embargo, no se puede decir que dicho sistema de producción de partículas del virus de la gripe que utiliza un promotor/terminador de la ARN polimerasa I sea superior a sistemas de producción convencionales de partículas de virus de la gripe en términos de cantidad...

1. Método para producir partículas infecciosas del virus de la hepatitis C (HCV), que comprende la etapa de introducir el siguiente vector de expresión i) o ii) en una célula que se selecciona del grupo que comprende Huh7, HepG2 y células de líneas celulares derivadas de las mismas:

2. Método, según la reivindicación 1, en el que la cepa del HCV es una cepa del HCV de genotipo 1 o genotipo 2.

3. Método, según la reivindicación 2, en el que la cepa del HCV de genotipo 1 se selecciona del grupo que comprende la cepa H77c, la cepa 1, la cepa H, la cepa HC-J1, la cepa J1, la cepa con1, la cepa TH, la cepa J, la cepa JT y la cepa BK.

4. Método, según la reivindicación 2, en el que la cepa del HCV de genotipo 2 se selecciona del grupo que comprende la cepa J6CF, la cepa JFH1, la cepa JCH1 y la cepa HC-J8.