Un método para producir un anticuerpo en un huésped procariota,

que comprende las etapas de:

a) construcción de un vector que comprende la región del promotor rhaBAD del operón L-ramnosa, ligado operablemente a una unidad transcripcional que comprende i) una secuencia de ácido nucleico que codifica un anticuerpo y ii) una secuencia señal procariota ligada operablemente a dicha secuencia de ácido nucleico, en donde la unidad transcripcional comprende una región de iniciación de traducción en dirección 5' del punto de inicio de la traducción de dicha unidad transcripcional, dicha región de iniciación de traducción constituida por la secuencia AGGAGATATACAT (SEQ ID NO. 2), mientras que dicha región de iniciación de traducción se liga operablemente a dicha secuencia de ácido nucleico, mientras que dicha secuencia señal procariota se selecciona de los péptidos señal de las proteínas de enlace periplásmicas seleccionadas del grupo constituido por LamB y MalE y, mientras que la expresión de dicha secuencia de ácido nucleico se controla por dicha región promotora,

b) transformación de un huésped procariota con dicho vector,

c) permitir la expresión de dicho polipéptido en un sistema de cultivo celular bajo condiciones apropiadas,

d) recuperación de dicho polipéptido a partir del sistema de cultivo celular

Sistema de expresión de un promotor ramnosa.

La presente invención se refiere a un método para producir anticuerpos en huéspedes procariotas, utilizando vectores que comprenden la región del promotor rhaBAD del operón L-ramnosa ligado operablemente a una unidad transcripcional que comprende

a) una secuencia de ácido nucleico que codifica un anticuerpo

b) una secuencia señal procariota ligada operablemente a dicha secuencia de ácido nucleico, mientras que dicha secuencia señal procariota se selecciona de los péptidos señal de proteínas de enlace periplasmáticas, en particular LamB y Ma1E, mientras que la expresión de dicha secuencia de ácido nucleico se controla por dicha región promotora.

Antecedentes de la invención

Muchos sistemas han sido descritos para la expresión heteróloga de ácidos nucleicos que codifican por ejemplo, polipéptidos tales como proteínas recombinantes en sistemas procariotas. Sin embargo, la mayoría de sistemas de expresión de genes heterólogos en sistemas procariotas huésped se han basado exclusivamente en un conjunto limitado de promotores bacterianos. La mayoría de los promotores procariotas ampliamente utilizados han incluido los promotores lactosa [lac] (Yanisch-Perron et al., 1985, Gene 33, 103-109), y triptófano [trp] (Goeddel et al., 1980, Nature (London) 287, 411-416), y los promotores híbridos derivados de estos dos [tac y trc] (Brosius, 1984, Gene 27:161-172; Amann and Brosius, 1985, Gene 40,183-190). Otros sistemas de promotor inducible tales como el promotor inducible araB por arabinosa (WO 86 04356), el promotor ramnosa rhaSB inducible por la L-ramnosa (WO 03068956) o el promotor ramnosa rhaBAD inducible por la L-ramnosa (WO 2004/050877) han sido descritos también para la expresión heteróloga de las proteínas. WO 2004/050877 describe el uso de un promotor rhaBAD para la expresión heteróloga de nitrilasa en E. coli. Después de la inducción con L-ramnosa, se podría obtener actividad de la nitrilasa en ensayos de células en reposo. Sin embargo, en particular para la expresión de polipéptidos complejos tales como los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos es ventajoso para exportar el polipéptido del citoplasma a ubicaciones no-citoplasmáticas (secreción) utilizando secuencias señal, ya que la sobreproducción de proteínas heterólogas en el citoplasma a menudo se acompaña por el plegado incorrecto y la segregación en agregados insolubles (cuerpos de inclusión). Sin embargo, ya que la secuencia señal puede influenciar la formación de la estructura secundaria y terciaria en la región madura de los polipéptidos secretores, la elección de la secuencia señal apropiada en combinación con un promotor útil es importante para la alta producción de polipéptidos funcionales. Por lo tanto, existe una necesidad de métodos para la producción de anticuerpos en sistemas de expresión procariotas.

Resumen de la invención

La presente invención resuelve este problema proporcionando un método para producir un anticuerpo en un huésped procariota, que comprende las etapas de:

a) construcción de un vector que comprende la región del promotor rhaBAD del operón L-ramnosa ligado operablemente a una unidad transcripcional que comprende i) una secuencia de ácido nucleico que codifica un anticuerpo y ii) una secuencia señal procariota ligada operablemente a dicha secuencia de ácido nucleico, en donde la unidad transcripcional comprende una región de iniciación de traducción en dirección 5' del punto de iniciación de la traducción de dicha unidad transcripcional, dicha región de iniciación de traducción compuesta de la secuencia AGGAGATATACAT (SEQ ID NO. 2), mientras que dicha región de iniciación de traducción se liga operablemente a dicha secuencia de ácido nucleico, mientras que dicha secuencia señal procariota se selecciona de los péptidos señal de proteínas de enlace periplásmicas seleccionadas del grupo compuesto de LamB y MalE y, mientras que la expresión de dicha secuencia de ácido nucleico se controla por dicha región promotora,

b) transformación de un huésped procariota con dicho vector,

c) permitir la expresión de dicho polipéptido en un sistema de cultivo celular bajo condiciones apropiadas,

d) recuperación de dicho polipéptido a partir del sistema de cultivo celular.

Otras ventajas serán aparentes para aquellos de habilidad en el oficio a partir de una revisión de la resultante descripción detallada, que proviene con referencia a los siguientes dibujos ilustrativos, y las reivindicaciones anexas.

Breve descripción de las figuras

Fig. 1 muestra el plásmido pBW22-Fab-H que contiene el promotor inducible por L-ramnosa (PrhaBAD), secuencias que codifican por las secuencias señal ligadas operablemente a la cadena ligera (ompA-VL3-CL) y la cadena pesada (phoA-VH-CH) de un fragmento Fab, y una región de terminación de la transcripción (rrnB).

Fig. 2 muestra el plásmido pBLL15 que contiene un promotor inducible por melibiosa (PmelAB2), secuencias que codifican por secuencias señal ligadas operablemente a la cadena ligera (ompA-VL3-CL) y la cadena pesada (phoA- VH-CH) de un fragmento Fab, y una región de terminación de la transcripción (rrnB).

Fig. 3 muestra los resultados del ensayo dot blot (con cadena ligera anti-humana para detectar Fab, peroxidasa alcalina conjugada) de extractos de lisozima de las cepas W3110 no inducidas (-) e inducidas (+) con los diferentes plásmidos de expresión. Los intervalos de tiempo se indican.

Fig. 4 muestra el plásmido pAKL14 que contiene el promotor inducible por L-ramnosa (PrhaBAD) y los genes Fab-H con las secuencias señal alteradas.

Fig. 5 muestra el ensayo dot blot de extractos de lisozima de cepa W3110 (pAKL14) inducida por L-ramnosa y no inducida (-). El tiempo cuando las muestras fueron tomadas se indica (con cadena ligera anti-humana para detectar Fab, peroxidasa alcalina conjugada).

Fig. 6 muestra el ensayo Western blot de extractos de lisozima de cepa W3110 inducida por L-ramnosa (pAKL14). El tiempo después de la inducción, cuando las muestras fueron tomadas se indica (con cadena ligera anti-humana para detectar Fab, peroxidasa alcalina conjugada). Senda 1: Estándar (1.28 µg); senda 2: W3110 (pAKL14), ind., 3 h; senda 3: W3110 (pAKL14), ind., 5 h; senda 4: W3110 (pAKL14), ind., 7 h; senda 5: W3110 (pAKL14), ind., 12 h; senda 6: W3110 (pAKL14), ind., 23 h; senda 7: W3110 (pAKL14), no ind., 23 h.

Fig. 7 muestra SDS-PAGE de extractos de lisozima de diferentes cepas W3110 con altas concentraciones del anticuerpo Fab-H. Las cepas que producen la cadena ligera y pesada sin secuencias señal se utilizan como una referencia negativa (senda 1: Marcador; senda 2: W3110 (pMx9-HuCAL-Fab-H); senda 3: W3110 (pBW22-Fab-H); senda 4: W3110 (pBLL1 5), senda 5: W3110 (pAYL14); senda 6: Estándar (2 µg)).

Fig. 8 muestra el plásmido pAKL15E que contiene el promotor inducible por melibiosa (PmelAB2) y los genes Fab-H con secuencias señal alteradas.

Fig. 9 muestra SDS-PAGE de extractos de lisozima de la cepa W3110 (pAKL15E) en la presencia o ausencia de la melobiasa inductora. La posición de la cadena ligera y pesada se indica (senda 1: Marcador; senda 2: W3110 (pAKL15E), no inducida; senda 3: W3110 (pAKL15E), inducida).

Fig. 10 muestra el plásmido pBW22-pelB-S1 que comprende el promotor inducible por L-ramnosa rhaBAD, una secuencia que codifica para un péptido señal PelB ligado operablemente a una secuencia que codifica para un anticuerpo de cadena sencilla (scFv, S1), y una región de terminación de la transcripción (rrnnB).

Fig. 11 muestra SDS-PAGE para extractos crudos de cepa W3110 no inducida (-) e inducida (+) (pBW22-pelB-S1). Las muestras fueron tomadas después de diferentes intervalos de tiempo como se indica. Se analizaron las fracciones de la proteína soluble e insoluble después del tratamiento de lisozima. Una flecha indica la proteína scFv. M = Mark12, estándar de peso molecular de Invitrogen.

Fig. 12 muestra el plásmido pJOE4782 de rango de huésped amplio que comprende el promotor inducible por L-ramnosa rhaBAD en combinación con los genes de las proteínas reguladoras RhaS y RhaR del operón L-ramnosa de Escherichia coli. El plásmido pJOE4782 además contiene una secuencia que codifica para un péptido señal MalE ligado operablemente a una secuencia que codifica para la proteína...

1. Un método para producir un anticuerpo en un huésped procariota, que comprende las etapas de:

a) construcción de un vector que comprende la región del promotor rhaBAD del operón L-ramnosa, ligado operablemente a una unidad transcripcional que comprende i) una secuencia de ácido nucleico que codifica un anticuerpo y ii) una secuencia señal procariota ligada operablemente a dicha secuencia de ácido nucleico, en donde la unidad transcripcional comprende una región de iniciación de traducción en dirección 5' del punto de inicio de la traducción de dicha unidad transcripcional, dicha región de iniciación de traducción constituida por la secuencia AGGAGATATACAT (SEQ ID NO. 2), mientras que dicha región de iniciación de traducción se liga operablemente a dicha secuencia de ácido nucleico, mientras que dicha secuencia señal procariota se selecciona de los péptidos señal de las proteínas de enlace periplásmicas seleccionadas del grupo constituido por LamB y MalE y, mientras que la expresión de dicha secuencia de ácido nucleico se controla por dicha región promotora,

b) transformación de un huésped procariota con dicho vector,

c) permitir la expresión de dicho polipéptido en un sistema de cultivo celular bajo condiciones apropiadas,

d) recuperación de dicho polipéptido a partir del sistema de cultivo celular.

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicho promotor rhaBAD consiste de la secuencia SEQ ID NO. 1, una secuencia complementaria de esta y las variantes de esta.

3. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicha región del promotor rhaBAD y dicha unidad transcripcional ligada operablemente consiste de la secuencia SEQ ID NO. 3, una secuencia complementaria de esta y las variantes de esta.

4. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicha región del promotor rhaBAD y dicha unidad transcripcional ligada operablemente consiste de la secuencia SEQ ID NO. 4, una secuencia complementaria de esta y las variantes de esta.

5. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el anticuerpo producido es un fragmento Fab.

6. El método de la reivindicación 5, en donde las cadenas pesada y ligera del fragmento Fab se expresan en dicho sistema de cultivo celular en cantidades iguales.

7. El método de acuerdo con la reivindicación 5 o 6, en donde la cadena pesada y la ligera de dicho fragmento Fab se codifican por una unidad transcripcional dicistrónica, mientras que cada cadena se liga operablemente a dicha secuencia señal procariota y una región de iniciación de traducción idéntica en dirección 5' del punto de inicio de la traducción de dicha unidad transcripcional.

8. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde dicha unidad transcripcional además comprende una región de terminación de la transcripción, que es la secuencia terminadora transcripcional rrnB.

9. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde dicho vector es un plásmido autonómico o de auto-replicación, un cósmido, un fago o un virus.

10. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, mientras que la expresión de dicho anticuerpo se realiza en medio que contiene glicerol.