SECUENCIAS DE NUCLEOTIDOS Y PROTEINAS DE GENES DELTA DE VERTEBRADOS Y METODOS BASADOS EN LOS MISMOS.
LA PRESENTE INVENCION ESTA RELACIONADA CON SECUENCIAS DE NUCLEOTIDOS DE GENES DELTA DE VERTEBRADOS Y SECUENCIAS DE AMINOACIDOS DE LAS PROTEINAS QUE CODIFICAN,
ASI COMO DERIVADOS (P.EJ., FRAGMENTOS) Y ANALOGOS DE LAS MISMAS. EN UNA REALIZACION ESPECIFICA, LA PROTEINA DELTA DE VERTEBRADOS ES UNA PROTEINA HUMANA. LA INVENCION ESTA RELACIONADA CON FRAGMENTOS (Y DERIVADOS Y ANALOGOS DE LOS MISMOS) DE DELTA QUE ABARCAN UNO O MAS DOMINIOS DE LA PROTEINA DELTA, INCLUIDOS PERO NO LIMITADOS AL DOMINIO INTRACELULAR, EL DOMINIO EXTRACELULAR, EL DOMINIO DSL, EL DOMINIO AMINOTERMINAL DEL DOMINIO DSL, LA REGION TRANSMEMBRANA O UNA O MAS REPETICIONES DE TIPO EGF DE UNA PROTEINA DELTA, O CUALQUIER COMBINACION DE LOS ANTERIORES. TAMBIEN SE PROPORCIONAN ANTICUERPOS FRENTE A LA PROTEINA DELTA Y SUS DERIVADOS Y ANALOGOS. TAMBIEN SE PROPORCIONAN METODOS DE PRODUCCION DE LAS PROTEINAS DELTA Y DE SUS DERIVADOS Y ANALOGOS, P.EJ., MEDIANTE TECNICAS RECOMBINANTES. SE PROPORCIONAN METODOS TERAPEUTICOS Y DIAGNOSTICOS YCOMPOSICIONES FARMACEUTICAS. EN EJEMPLOS ESPECIFICOS, SE PROPORCIONAN GENES DELTA AISLADOS DE XENOPUS, POLLUELO, RATON Y SERES HUMANOS
Tipo: Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: W9611178US.
Solicitante: IMPERIAL CANCER RESEARCH TECHNOLOGY LIMITED
YALE UNIVERSITY.
Nacionalidad solicitante: Reino Unido.
Dirección: SARDINIA HOUSE, SARDINIA STREET,LONDON WC2A 3NL.
Inventor/es: ARTAVANIS-TSAKONAS, SPYRIDON, ISH-HOROWICZ,DAVID, LEWIS,JULIAN,H, HENRIQUE,DOMINGO,M.,P, GRAY,GRACE,E.
Fecha de Publicación: .
Fecha Concesión Europea: 9 de Septiembre de 2009.
Clasificación Internacional de Patentes:
- C07K14/705 QUIMICA; METALURGIA. › C07 QUIMICA ORGANICA. › C07K PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas C07D; ipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina diones-2,5, C07D; alcaloides del cornezuelo del centeno de tipo péptido cíclico C07D 519/02; proteínas monocelulares, enzimas C12N; procedimientos de obtención de péptidos por ingeniería genética C12N 15/00). › C07K 14/00 Péptidos con más de 20 aminoácidos; Gastrinas; Somatostatinas; Melanotropinas; Sus derivados. › Receptores; Antígenos celulares de superficie; Determinantes celulares de superficie.
Clasificación PCT:
- C07H17/00 C07 […] › C07H AZUCARES; SUS DERIVADOS; NUCLEOSIDOS; NUCLEOTIDOS; ACIDOS NUCLEICOS (derivados de ácidos aldónicos o sacáricos C07C, C07D; ácidos aldónicos, ácidos sacáricos C07C 59/105, C07C 59/285; cianohidrinas C07C 255/16; glicales C07D; compuestos de constitución indeterminada C07G; polisacáridos, sus derivados C08B; ADN o ARN concerniente a la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos o su aislamiento, preparación o purificación C12N 15/00; industria del azúcar C13). › Compuestos que contienen radicales heterocíclicos unidos directamente a los heteroátomos de los radicales sacárido.
- C07K14/00 C07K […] › Péptidos con más de 20 aminoácidos; Gastrinas; Somatostatinas; Melanotropinas; Sus derivados.
- C07K14/705 C07K 14/00 […] › Receptores; Antígenos celulares de superficie; Determinantes celulares de superficie.
- C12N15/00 C […] › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K).
- C12N5/00 C12N […] › Células no diferenciadas humanas, animales o vegetales, p. ej. líneas celulares; Tejidos; Su cultivo o conservación; Medios de cultivo para este fin (reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00).
- C12P21/06 C12 […] › C12P PROCESOS DE FERMENTACION O PROCESOS QUE UTILIZAN ENZIMAS PARA LA SINTESIS DE UN COMPUESTO QUIMICO DADO O DE UNA COMPOSICION DADA, O PARA LA SEPARACION DE ISOMEROS OPTICOS A PARTIR DE UNA MEZCLA RACEMICA. › C12P 21/00 Preparación de péptidos o de proteínas (proteína monocelular C12N 1/00). › preparados por hidrólisis de un enlace peptídico, p. ej. hidrolizados.
Clasificación antigua:
- C07H17/00 C07H […] › Compuestos que contienen radicales heterocíclicos unidos directamente a los heteroátomos de los radicales sacárido.
- C07K14/00 C07K […] › Péptidos con más de 20 aminoácidos; Gastrinas; Somatostatinas; Melanotropinas; Sus derivados.
- C12N15/00 C12N […] › Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K).
- C12N5/00 C12N […] › Células no diferenciadas humanas, animales o vegetales, p. ej. líneas celulares; Tejidos; Su cultivo o conservación; Medios de cultivo para este fin (reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00).
- C12P21/06 C12P 21/00 […] › preparados por hidrólisis de un enlace peptídico, p. ej. hidrolizados.
Fragmento de la descripción:
Secuencias de nucleótidos y proteínas de genes Delta de vertebrados y métodos basados en los mismos.
Esta solicitud reivindica la prioridad de la solicitud provisional de EE.UU. con Nº. de serie 60/000.589 presentada el 28 de junio de 1995.
1. Introducción
La presente invención se refiere a genes Delta de vertebrados y a sus productos proteicos codificados, así como a sus derivados y análogos. También se proporciona la producción de proteínas Delta de vertebrados, derivados y anticuerpos. La invención además se refiere a composiciones terapéuticas y métodos diagnósticos y terapéuticos.
2. Antecedentes de la invención
Los análisis genéticos en Drosophila han sido muy útiles en el estudio de la complejidad de las rutas de desarrollo y en la identificación de loci que interaccionan. Sin embargo, comprender la naturaleza precisa de los procesos que subyacen a las interacciones genéticas requiere conocer los productos proteicos de los genes en cuestión.
El sistema nervioso central de los vertebrados es una mezcla selecta de diferentes tipos de células, casi todas generadas de la misma fuente - el neuroepitelio que forma la placa neural y posteriormente el tubo neural. Cuáles son los mecanismos que controlan la neurogénesis en esta lista de células, dirigiendo algunas a volverse neuronas mientras que otras quedan como no neuronales? La respuesta es prácticamente desconocida para los vertebrados, aunque muchas de las interacciones celulares y genes que controlan las decisiones del destino de las células durante la neurogénesis están muy caracterizadas en Drosophila (Campos-Ortega, 1993, J. Neurobiol. 24:1305-1327). Aunque el grueso contexto anatómico de la neurogénesis parezca muy diferente entre insectos y vertebrados, queda la posibilidad de que, a un nivel celular, ocurran acontecimientos similares mediante mecanismos moleculares conservados. Ciertas pruebas embriológicas, genéticas y moleculares indican que las etapas iniciales de la diferenciación ectodérmica en Drosophila dependen de las interacciones celulares (Doe y Goodman, 1985, Dev. Biol. 111:206-219; Technau y Campos-Ortega, 1986, Dev. Biol. 195:445-454; Vässin et al., 1985, J. Neurogenet. 2:291-308; de la Concha et al., 1988, Genetics 118:499-508; Xu et al., 1990, Genes Dev. 4:464-475; Artavanis-Tsakonas, 1988, Trends Genet. 4:95-100). Los análisis mutacionales muestran un pequeño grupo de genes que actúan a través de cigotos, los denominados loci neurogénicos, que afectan a la elección de las células ectodérmicas entre rutas epidérmicas y neuronales (Poulson, 1937, Proc. Natl. Acad. Sci. 23:133-137; Lehmann et al., 1983, Wilhelm Roux's Arch. Dev. Biol. 192:62-74; Jürgens et al., 1984, Wilhelm Roux's Arch. Dev. Biol. 193:283-295; Wieschaus et al., 1984, Wilhelm Roux's Arch. Dev. Biol. 193:296-307; Nüsslein-Volhard et al., 1984, Wilhelm Roux's Arch. Dev. Biol. 193:267-282). Las mutaciones anuladoras en cualquiera de los loci neurogénicos zigóticos - Notch (N), Delta (D1), mastermind (mam), Enhancer of Split (E(spl), neuralized (neu) y big brain (bib) - causan hipertrofia del sistema nervioso a costa de estructuras epidérmicas ventrales y laterales. Este efecto es debido al erróneo encaminamiento de las células precursoras epidérmicas en una ruta neuronal, e implica que la función de los genes neurogénicos es necesaria para desviar a las células dentro de la región neurogénica desde un destino neuronal a un destino epitelial.
Los precursores neuronales surgen en el embrión de Drosophila a partir de un epitelio neurogénico durante olas sucesivas de neurogénesis (Campos-Ortega y Hartenstein, 1985, "The embryonic development of Drosophila melanogaster" (Springer-Verlag, Berlín; Nueva York); Doe, 1992, Development 116:855-863). El modelo de producción de estas células está, en gran parte, determinado por la actividad de los genes proneuronales y neurogénicos. Los genes proneuronales predisponen agrupaciones de células hacia un destino neuronal (revisado en Skeath y Carroll, 1994, Faseb J. 8:714-21), pero sólo un subconjunto de células en una agrupación se vuelve precursor neuronal. Esta restricción es debida a la acción de los genes neurogénicos, que median la inhibición lateral - un tipo de señalización celular inhibitorias mediante la cual una célula comprometida en un destino neuronal obliga a sus vecinas a permanecer no comprometidas o a entrar en una ruta no neuronal (Artavanis-Tsakonas y Simpson, 1991, Trends Genet. 7:403-408; Doe y Goodman, 1985, Dev. Biol. 111:206-219). Las mutaciones que conducen a un fracaso de la inhibición lateral causan una superproducción de neuronas - el fenotipo "neurogénico" (Lehmann et al., 1981, Roux's Arch. Dev. Biol. 190:226-229; Lehmann et al., Roux's Arch. Dev. Biol. 192:62-74). En Drosophila, la señal inhibitoria es administrada por una proteína transmembrana codificada por el gen neurogénico Delta, que es expresado por las neuronas nacientes (Heitzler y Simpson, 1991, Cell 64:1083-1092). Las células vecinas expresan una proteína del receptor de transmembrana, codificada por el gen neurogénico Notch (Fortini y Artavanis-Tsakonas, 1993, Cell 75:1245-1247). Se ha identificado Delta como una unidad genética capaz de interaccionar con el locus de Notch (Xu et al., 1990, Genes Dev. 4:464-475).
Los análisis mutacionales también muestran que la acción de los genes neurogénicos es pleiotrópica y no está limitada únicamente a la embriogénesis. Por ejemplo, la formación de omatidios, cerdas y alas, que se sabe que también depende de las interacciones celulares, está afectada por mutaciones neurogénicas (Morgan et al., 1925, Bibliogr. Genet. 2:1-226; Welshons, 1956, Dros. Inf. Serv. 30:157-158; Preiss et al., 1988, EMBO J. 7:3917-3927; Shellenbarger y Mohler, 1978, Dev. Biol. 62:432-446; Technau y Campos-Ortega, 1986, Wilhelm Roux's Dev. Biol. 195:445-454; Tomlison y Ready, 1987, Dev. Biol. 120:366-376; Cagan y Ready, 1989, Genes Dev. 3:1099-1112). Los genes neurogénicos también son requeridos para el desarrollo normal de los músculos, intestino, sistemas excretorios y reproductivos de la mosca (Muskavitch, 1994, Dev. Biol. 166:415-430).
Tanto Notch como Delta son proteínas transmembrana que atraviesan la membrana una sola vez (Wharton et al., 1985, Cell 43:567-581; Kidd y Young, 1986, Mol. Cell. Biol. 6:3094-3108; Vässin, et al., 1987, EMBO J. 6:3431-3440; Kopczynski, et al., 1988, Genes Dev. 2:1723-1735) e incluyen repeticiones del tipo EGF tándem múltiples en sus dominios extracelulares (Muskavitch, 1994, Dev. Biol. 166:415-430). El gen Notch codifica una proteína de 300 kd (se usa "Notch" para denominar a esta proteína) con un gran dominio extracelular del extremo N-terminal que incluye 36 repeticiones tándem del tipo (EGF) del factor de crecimiento epidérmico seguido de otras tres repeticiones ricas en cisteína, denominadas repeticiones Notch/lin-12 (Wharton, et al., 1985, Cell 43:567-581; Kidd y Young, 1986, Mol. Cell. Biol. 6:3094-3108; Yochem, et al., 1988, Nature 335:547-550). Los estudios moleculares han sugerido que Notch y Delta constituyen elementos que se relacionan bioquímicamente de un mecanismo de comunicación celular implicado en decisiones del desarrollo inicial (Fehon et al., 1990, Cell 61:523-534). Se encuentran homólogos en Caenorhabditis elegans, donde el gen relacionado con Notch lin-12 y el gen relacionado con Delta lag-2 son también responsables de inhibición lateral (Sternberg, 1993, Current Biol. 3:763-765; Henderson et al., 1994, Development 120:2913-2924; Greenwald, 1994, Curr. Opin. Genet. Dev. 4:556-562). En vertebrados, también se han identificado varios homólogos de Notch (Kopan y Weintraub, 1993, J. Cell Biol. 121:631-641; Lardelli et al., 1994, Mech....
Reivindicaciones:
1. Una proteína Delta humana purificada que consiste en al menos 20 aminoácidos continuos de la secuencia de aminoácidos numerada de 1 a 175 en la Figura 11, en la que dicha proteína es capaz de unirse a una proteína Notch.
2. Una proteína Delta humana purificada según la reivindicación 1, que consiste en al menos 50 aminoácidos continuos de la secuencia de aminoácidos numerada de 1 a 175 en la Figura 11.
3. Una proteína Delta humana purificada según la reivindicación 1 o la reivindicación 2 que carece de la secuencia de señalización de la proteína Delta humana.
4. Un fragmento purificado de una proteína Delta humana según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, cuyo fragmento consiste en al menos 20 aminoácidos continuos de la secuencia de aminoácidos numerada de 1 a 175 en la Figura 11, cuyo fragmento es capaz de unirse a una proteína Notch.
5. Un fragmento purificado según la reivindicación 4, cuyo fragmento consiste en al menos 75 aminoácidos continuos de la secuencia de aminoácidos numerada de 1 a 175 en la Figura 11.
6. Un fragmento purificado según la reivindicación 4 o la reivindicación 5, cuyo fragmento no es más grande que 200 aminoácidos.
7. Un fragmento purificado según la reivindicación 6, cuyo fragmento no es más grande que 100 aminoácidos.
8. Un fragmento purificado según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7, cuyo fragmento comprende el dominio extracelular, la región extremo amino-terminal respecto al dominio DSL, el dominio DSL, dominio de repetición tipo factor de crecimiento epidérmico, el dominio transmembrana o el dominio intracelular de la proteína Delta humana.
9. Un fragmento purificado según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 8 que carece de los dominios transmembrana e intracelular de la proteína Delta humana.
10. Un derivado purificado de una proteína Delta humana según la reivindicación 2 o de un fragmento según la reivindicación 5 o cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9 cuando es directamente o indirectamente dependiente en la reivindicación 5, cuyo derivado tiene la secuencia de aminoácidos de dicha proteína Delta humana o fragmento en el que un residuo de aminoácidos dentro de la secuencia es sustituido por otro aminoácido de una polaridad similar que actúa como un equivalente funcional dando como resultado una modificación silenciosa, y cuyo derivado es capaz de unirse a una proteína Notch.
11. Una proteína quimérica que comprende una proteína Delta humana según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, un fragmento según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 9, o un derivado según la reivindicación 10, fusionado mediante un enlace covalente a una secuencia de aminoácidos de una segunda proteína, cuya segunda proteína no es la proteína Delta.
12. Una molécula que comprende un fragmento según la reivindicación 9.
13. Un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica:
una proteína Delta humana según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3;
un fragmento según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 9;
un derivado según la reivindicación 10; o
una proteína quimérica según la reivindicación 11.
14. Un ácido nucleico aislado según la reivindicación 13 que es un vector de clonación o un vector de expresión.
15. Una célula recombinante transformada con el vector de clonación o el vector de expresión según la reivindicación 14.
16. Un método para producir una proteína Delta humana, fragmento, derivado o proteína quimérica que comprende hacer crecer la célula recombinante según la reivindicación 15 tal que la proteína Delta humana codificada, fragmento, derivado o proteína quimérica se expresa por la célula y recupera la proteína expresada, el fragmento, derivado o proteína quimérica.
17. Un anticuerpo frente a la secuencia de aminoácidos numerada de 1 a 175 en la Figura 11, cuyo anticuerpo es inmunoespecífico frente a una proteína Delta humana según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
18. Un anticuerpo según la reivindicación 17, que es un anticuerpo monoclónico.
19. Un anticuerpo según la reivindicación 17, que es un anticuerpo policlónico.
20. Un fragmento del anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 17 a 19 que contiene el idiotipo del anticuerpo.
21. Un anticuerpo según la reivindicación 17 ó 18, cuyo anticuerpo es un anticuerpo quimérico o humano.
22. Una molécula que comprende un fragmento del anticuerpo monoclónico según la reivindicación 18, cuyo fragmento es capaz de unirse a una proteína Delta humana según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
23. Un método para producir un anticuerpo, cuyo método comprende inmunizar un animal huésped no humano con una proteína Delta humana según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, un fragmento según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 9 o una proteína quimérica según la reivindicación 11 y seleccionar un anticuerpo que se une a dicha proteína Delta humana o fragmento.
24. Un oligonucleótido aislado de al menos quince nucleótidos que son antisentido y complementarios respecto a la secuencia de nucleótidos en las Figuras 10A-10B.
25. Un método para inhibir la expresión de una proteína Delta humana en una célula que comprende proporcionar la célula in vitro con una cantidad eficaz del oligonucleótido según la reivindicación 24.
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