RECEPTORES DE LA NEUROTOXINA BOTULINICA B Y SU USO.

Uso de un agente que reduce la unión entre BoNT/B y su receptor en la superficie celular en la fabricación de un medicamento para reducir la toxicidad de BoNT/B en un sujeto humano o un sujeto animal no humano,

donde el agente comprende (i) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre los aminoácidos 1-87 de la SEC ID Nº: 7, los aminoácidos 40-267 de la SEC ID Nº: 7, los aminoácidos 1-267 de la SEC ID Nº: 7, los aminoácidos 1-422 de la SEC ID Nº: 7 y (ii) un gangliósido

Receptores de la neurotoxina botulínica B y su uso.

Referencia cruzada a solicitudes relacionadas

Declaración en relación con la investigación o desarrollo patrocinado federalmente

Esta invención se realizó con la ayuda del gobierno de los Estados Unidos otorgada por las siguientes agencias: NIH MH61876 y GM56827. El gobierno de los Estados Unidos tiene ciertos derechos en esta invención.

Antecedentes de la invención

Las neurotoxinas de clostridios (CNT) son las sustancias más tóxicas conocidas. Hay ocho toxinas relacionadas - siete neurotoxinas botulínicas (BoNT/A-G) y una neurotoxina tetánica (TeNT) (Schiavo et al., 2000; Simpson, 1981). Las BoNT pueden producir botulismo y son posibles armas biológicas (Arnon et al., 2001; Mahant et al., 2000). Tanto las BoNT como la TeNT están compuestas por una cadena pesada y ligera; la cadena pesada media la unión a la superficie de terminales nerviosas específicas. Una vez internalizada por endocitosis, la cadena ligera se transloca desde el lumen de la vesícula al citoplasma, donde funciona como proteasa dependiente de cinc (Schiavo et al., 2000). La cadena ligera escinde uno o más componentes de un complejo de fusión a la membrana conservado compuesto de sintaxina, SNAP-25 y sinaptobrevina (syb), bloqueando de esta manera la exocitosis (Blasi et al., 1993a; Blasi et al., 1993b; Schiavo et al., 1992; Schiavo et al., 1993). Debido a su capacidad de interrumpir selectivamente la exocitosis inducida por Ca²⁺, las CNT han surgido como herramientas importantes para el estudio de la fusión a la membrana y la transmisión sináptica (Jahn y Niemann, 1994).

La primera etapa en la acción de las CNT implica la unión a receptores en la superficie de las neuronas. Los indicios actuales sugieren que los receptores están compuestos de gangliósidos y proteínas que cooperan para formar sitios de unión a toxinas de alta afinidad. Como alternativa, los gangliósidos pueden constituir sitios de unión a toxina con una afinidad relativamente baja que sirven para capturar las CNT para facilitar interacciones con proteínas receptoras de la superficie celular (Montecucco, 1986; Nishiki et al., 1996a). Los gangliósidos son glicoesfingolípidos ubicuos en la cara externa de las membranas plasmáticas. Se clasifican de acuerdo con el número y las posiciones de los ácidos siálicos presentes en sus grupos de cabeza. Los polisialiogangliósidos, que están presentes casi exclusivamente en neuronas y en células neuroendocrinas, se unen a las CNT con la máxima avidez (Halpern y Neale, 1995). Aunque en el reconocimiento toxina-célula también está implicado claramente un componente proteico, en el momento actual no se ha identificado una proteína que medie la entrada de la toxina (Schiavo et al., 2000).

Estudios bioquímicos han llevado a la identificación de un puñado de proteínas de unión a CNT. En la mayoría de los casos, estas proteínas de unión no parecen funcionar como receptores que median la entrada de las toxinas. Por ejemplo, se notificó que BoNT/A,B,E y TeNT se unían a sinapsina I y aducina, respectivamente (Schengrund et al., 1996; Schengrund et al., 1993; Schengrund et al., 1992). Como ninguna de estas proteínas está expuesta en la superficie externa de las células, es poco probable que funcionen como receptores de la superficie celular. Se notificó que TeNT se unía a Thy-1, una proteína de la membrana plasmática anclada a GPI. Sin embargo, las neuronas de ratones que carecen de Thy-1 siguen siendo sensibles a TeNT, lo que sugiere que Thy-1 no es esencial para la entrada de TeNT en las células (Herreros et al., 2001).

Las sinaptotagminas (syt) I y II (Nishiki et al., 1994) son proteínas de membrana de la vesícula sináptica homólogas que se cree que funcionan como sensores de Ca²⁺ para la exocitosis (Chapman, 2002; Schiavo et al., 1998). Se notificó que Syt I y II se unía a BoNT/B en presencia de gangliósidos; la constante de disociación para el complejo syt I•BoNT/B era de 2,3 nM y la constante de disociación para syt II•BoNT/B era de 0,23 nM. (Nishiki et al., 1996a). La unión de alta afinidad de BoNT/B a fibroblastos se reconstituyó por expresión de syt II e incorporación de ganglósidos exógenos en membranas de la superficie. Sin embargo, la unión no producía la escisión de la proteína diana de BoNT/B, syb II, que se había co-expresado con syt II, lo que indica que la toxina no se internalizaba (Nishiki et al., 1996b). Aunque los estudios bioquímicos establecían claramente que syt se une a BoNT/B, no existen indicios de que la unión media la entrada en las células. De esta manera, sigue sin saberse si esta interacción tiene algún papel funcional. Más recientemente, también se ha notificado que BoNT/A y E se unen a syt I, aunque de una manera independiente de gangliósidos (Li y Singh, 1998).

Syt II es una proteína de 422 aminoácidos que contiene un dominio luminal (a.a. 1-60), un dominio transmembrana (a.a. 61-87) y un dominio citoplásmico (a.a. 88-422). El dominio citoplásmico contiene dos dominios C2: C2A (a.a. 88-267) y C2B (a.a. 275-422) unidos por una región enlazadora (a.a. 268-274).

La determinación de si cualquiera de las proteínas anteriores, o quizás otras proteínas, sirve como receptor de BoNT/B será extremadamente útil para diseñar moléculas que puedan reducir o inhibir completamente la toxicidad de BoNT/B. Por la misma razón, una vez que se ha identificado un receptor, es importante localizar el dominio de unión a BoNT porque podrían usarse polipéptidos que contienen el dominio y peptidomiméticos de los mismos para competir con el receptor por la unión a BoNT, reduciendo o inhibiendo completamente de esta manera la toxicidad de BoNT.

Breve compendio de la invención

La presente invención se basa en la identificación de syt I y II como receptores de BoNT/B así como en la identificación de los dominios de unión a BoNT/B en syt I y II.

La presente invención proporciona el uso de un agente que reduce la unión entre BoNT/B y su receptor de la superficie celular en la fabricación de un medicamento para reducir la toxicidad de BoNT/B en un sujeto humano o un sujeto animal no humano, donde el agente comprende (i) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre los aminoácidos 1-87 de la SEC ID Nº: 7, los aminoácidos 40-267 de la SEC ID Nº: 7, los aminoácidos 1-267 de la SEC ID Nº: 7, los aminoácidos 1-422 de la SEC ID Nº: 7 y (ii) un gangliósido.

La presente invención proporciona además un agente que reduce la unión entre BoNT/B y su receptor de la superficie celular para uso en la reducción de la toxicidad de BoNT/B en un sujeto humano o un sujeto animal no humano, donde el agente comprende (i) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre los aminoácidos 1-87 de la SEC ID Nº: 7, los aminoácidos 40-267 de la SEC ID Nº: 7, los aminoácidos 1-267 de la SEC ID Nº: 7, los aminoácidos 1-422 de la SEC ID Nº: 7 y (ii) un gangliósido.

La presente invención además proporciona un método para detectar BoNT/B o Clostridium botulinum que comprende las etapas de:

exponer una muestra que se sospecha que contiene BoNT/B a un polipéptido que comprende los aminoácidos 40-60 de la SEC ID Nº: 7, siempre que se excluya un polipéptido que comprende una sinaptotagmina I o II de longitud completa; y

detectar la unión del polipéptido a BoNT/B.

También se hace referencia a un ácido nucleico aislado que contiene una secuencia codificante para el dominio de unión a BoNT/B de syt I o II de rata, ratón o humano, o para una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 70%, 80%, 90% o 95% con el dominio de unión a BoNT/B anterior. También se hace referencia a un ácido nucleico aislado que tiene una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de al menos 80% con la secuencia codificante del dominio de unión a BoNT/B de syt I y II de rata, ratón o humano o que hibrida con la secuencia codificante en condiciones de hibridación rigurosas o moderadamente rigurosas. El ácido nucleico de la presente invención puede proporcionarse en un vector o célula hospedadora y unirse de forma operativa a una secuencia de control de la expresión no nativa. En el caso de syt I y II humanos, los dominios de unión a BoNT/B son los aminoácidos 33-53 y 37-57, respectivamente. Para syt I y II de rata o ratón, los dominios de unión a BoNT/B son los aminoácidos 32-52 y 40-60, respectivamente.