Procedimiento para la identificación de moduladores de la unión de CCX CKR a una quimioquina,

que comprende:

(a) poner en contacto un polipéptido CCX CKR aislado o recombinante y la quimioquina en presencia de un compuesto de ensayo; en el que:

el polipéptido CCX CKR (i) comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº 2, o es un fragmento o variante de la misma, en el que la variante presenta una identidad de secuencias de por lo menos el 90% respecto de la secuencia SEC ID nº 2, e (ii) puede unirse a la quimioquina en ausencia del compuesto de ensayo; y

la quimioquina se selecciona de entre el grupo constituido por quimioquina de ligando EBI-1 (ELC), quimioquina de órgano linfoide secundario (SLC), quimioquina expresada en el timo (TECK), quimioatrayente de linfocito B (BLC), quimioquina atrayente de célula T cutánea (CTACK), proteína-I? inflamatoria de macrófagos murinos (mMIP-I?) y proteína II inflamatoria de macrófagos (vMIPII); y

(b) comparar el nivel de unión de la quimioquina y el polipéptido CCX CKR en (a) con el nivel de unión en ausencia del compuesto de ensayo;

en el que una reducción de la unión indica que el compuesto de ensayo es un inhibidor de la unión, e indicando un incremento que el compuesto de ensayo es un intensificador de la unión

Receptor de quimioquina.

Campo de la invención

La invención se refiere a un receptor de quimioquina humana, y a composiciones y procedimiento que resultan útiles para diagnosticar y tratar condiciones fisiológicas y patológicas mediadas por el receptor y su ligando. La invención encuentra aplicación en las ciencias biomédicas.

Referencia cruzada con solicitudes relacionadas

La presente solicitud reivindica la prioridad con respecto a las solicitudes provisionales de patentes US nº 60/ 159015 (presentada el 12 de octubre de 1999), nº 60/159210 (presentada el 13 de octubre de 1999), nº 60/172979 (presentada el 20 de diciembre de 1999), nº 60/173389 (presentada el 28 de diciembre de 1999) y nº 60/186626 (presentada el 3 de marzo de 2000).

Antecedentes de la invención

Las quimioquinas son una clase de citoquinas que desempeña importantes papeles en las respuestas inflamatorias, tráfico de leucocitos, angiogénesis y otros procesos biológicos relacionados con la migración y activación de las células. Como mediadores de la quimotaxis y la inflamación, las quimioquinas desempeñan papeles en algunas condiciones patológicas. Por ejemplo, la concentración de la quimioquina MCP-1 es más alta en el líquido sinovial de pacientes que sufren artritis reumatoide que en pacientes que sufren otras enfermedades artríticas.

Las quimioquinas conocidas típicamente se clasifican en cuatro subfamilias basándose en la disposición de los motivos de cisteína. En las denominadas quimioquinas alfa, por ejemplo, las primeras dos de las cuatro cisteínas (partiendo del extremo amino-terminal) se encuentran separadas por un aminoácido intermedio (es decir, que presenta el motivo C-X-C). Las quimioquinas beta se caracterizan por la ausencia de un aminoácido intermedio entre las dos primeras cisteínas (es decir, que comprenden el motivo C-C). Las familias de quimioquinas gamma y delta, más pequeñas, se caracterizan por un único residuo de C (gamma) o por un par de cisteínas separadas por tres residuos (delta, es decir, que comprende el motivo CX₃C). Para una revisión reciente de las quimioquinas, ver Ward et al., Immunity 9:1-11, 1998, y Baggiolini et al., Nature 392:565-568, 1998, y las referencias citadas en las mismas.

La actividad de las quimioquinas puede encontrarse mediada por aceptores. Por ejemplo, se han clonado varios receptores de siete dominios transmembranales acoplados a proteína G para las quimioquinas C-C: un receptor 1 de quimioquina C-C que reconoce MIP-Ia, RANTES, MCP-2, MCP-3 y MIP-5 (Neote et al., Cell 72:415-415, 1993); CCR2, que es un receptor de MCP1, 2, 3 y 4 ó 5; CCR3, que es un receptor de RANTES, MCP-2, 3, 4, MIP-5 y eotaxina; CCR5, que es un receptor de MIP-1a, MIP-1ß y RANTES; CCR4, que es un receptor de MDC o TARC; CCR6, que es un receptor de LARC; y CCR7, que es un receptor de SLC y ELC (MIP-3ß; revisado en Sallusto et al., Immunol. Today 19:568, 1998, y Ward et al., Immunity 9:1-11, 1998).

Debido a la importancia de las quimioquinas y de sus receptores como mediadores de la quimotaxis y la inflamación, existe una necesidad de identificar, aislar y caracterizar los miembros de la familia de receptores de quimioquina con el fin de facilitar la modulación de las respuestas inflamatorias e inmunológicas.

Sumario de la invención

En la presente memoria, se describe un nuevo receptor de quimioquina, CCX CKR.

En la presente memoria, se describe un polipéptido CCX CKR sustancialmente puro o recombinante, o un fragmento inmunogénico del mismo. En un caso descrito en la presente memoria, la secuencia de aminoácidos del polipéptido es idéntica a la secuencia SEC ID nº 2. En otro descrito en la presente memoria, el polipéptido con una secuencia de aminoácido que difiere de la secuencia SEC ID nº 2 en mutaciones conservadoras, que es idéntico por lo menos al 60%, 80% o 90% a la secuencia SEC ID nº 2, y/o que presenta reactividad inmunológica cruzada con el polipéptido de longitud completa codificado por la secuencia SEC ID nº 2.

En un caso descrito en la presente memoria, el polipéptido es una proteína de fusión. En algunos casos descritos en la presente memoria, el polipéptido presenta una actividad del CCX CKR, tal como la unión a una quimioquina (por ejemplo ELC, SLC, TECK, BLC o vMIPII). En un caso descrito en la presente memoria, el polipéptido se une a ELC, SLC y TECK con alta afinidad.

En un aspecto relacionado, se describe en la presente memoria un polinucleótido aislado que codifica, o que es complementario a una secuencia que codifica, el polipéptido CCX CKR. En algunos casos descritos en la presente memoria, el polipéptido presenta por lo menos 10, 15, 25, 50 ó 100 bases contiguas idénticas o exactamente complementarias a la secuencia SEC ID nº 1. En diversos casos descritos en la presente memoria, el polinucleótido es la secuencia de longitud completa de la secuencia SEC ID nº 1, codifica un polipéptido CCX CKR de la invención (por ejemplo que presenta la secuencia de SEC ID nº 2 o un fragmento de la misma), o que se hibrida selectivamente bajo condiciones de hibridación altamente astringentes a una secuencia polinucleótida de secuencia SEC ID nº 1. El polinucleótido puede unirse operablemente a un promotor. En la presente memoria se describe un vector recombinante (por ejemplo un vector de expresión) que expresa los polipéptidos CCX CKR. En un aspecto, se describe en la presente memoria un polinucleótido que presenta una secuencia codificante de un polipéptido que presenta una actividad (por ejemplo una actividad de unión a quimioquina) o un polipéptido CCX CKR y que es: (a) un polinucleótido que presenta la secuencia SEC ID nº 1 o SEC ID nº 3, o (b) un polinucleótido que se hibrida bajo condiciones astringentes a (a), o (c) una secuencia polinucleótida degenerada como resultado del código genético respecto de las secuencias definidas en (a) o (b).

Se describe adicionalmente una célula (por ejemplo una célula bacteriana, eucariótica, de mamífero o humana) que contiene un polinucleótido CCX CKR recombinante y proporciona un procedimiento para producir una proteína CCX CKR, péptido o proteína de fusión mediante el cultivo de una célula que contiene el polinucleótido CCX CKR recombinante bajo condiciones en las que se expresa el polipéptido.

En otro caso, la memoria describe un anticuerpo, o fragmento de anticuerpo, o fragmento ligante (por ejemplo producido mediante expresión fágica) que se une específicamente al polipéptido CCX CKR de la invención. El anticuerpo puede ser monoclonal y puede unirse con una afinidad de por lo menos aproximadamente 10⁸ M^-1. También se describe una célula aislada o un hibridoma capaz de secretar el anticuerpo. El anticuerpo puede ser humano o humanizado.

En la presente memoria, se describe un procedimiento para detectar un producto génico CCX CKR en una muestra mediante: (a) la puesta en contacto de la muestra con una sonda que se une específicamente al producto génico, en el que la sonda y el producto génico forman un complejo, y detectar la formación del complejo, o (b) amplificar específicamente el producto génico en la muestra biológica, en la que dicho producto génico es un polinucleótido, y detectar el producto de amplificación; en el que la formación del complejo o la presencia del producto de amplificación se correlaciona con la presencia del producto génico CCX CKR en la muestra biológica. En un caso descrito en la presente memoria, el producto génico es un polipéptido y la sonda es un anticuerpo. En un caso diferente descrito en la presente memoria, el producto génico es un ARN y la sonda es un polinucleótido.

En la presente memoria, se describe un procedimiento para determinar si un compuesto interacciona o no directamente con el polipéptido CCX CKR, mediante la puesta en contacto de una quimioquina y el polipéptido CCX CKR o un fragmento del mismo que se una a ligandos, la adición de un compuesto de ensayo y la medición de cualquier reducción de la unión de la quimioquina. En diversos casos la quimioquina es ELC, SLC, TECK, BLC, mCTACK, mMIP-I? o vMIPIII u otro ligando natural que se una a CCX CKR. En algunos casos, la quimioquina se marca radiactivamente. De esta manera, en un aspecto, la invención proporciona un procedimiento para identificar un modulador de la unión de CCX CKR a una quimioquina mediante: (a) la puesta en contacto de un polipéptido CCX CKR y la quimioquina en presencia de un compuesto de ensayo, y (b) la comparación entre el nivel de unión de la quimioquina y el polipéptido en (a)...

1. Procedimiento para la identificación de moduladores de la unión de CCX CKR a una quimioquina, que comprende:

(a) poner en contacto un polipéptido CCX CKR aislado o recombinante y la quimioquina en presencia de un compuesto de ensayo; en el que:

el polipéptido CCX CKR (i) comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº 2, o es un fragmento o variante de la misma, en el que la variante presenta una identidad de secuencias de por lo menos el 90% respecto de la secuencia SEC ID nº 2, e (ii) puede unirse a la quimioquina en ausencia del compuesto de ensayo; y

la quimioquina se selecciona de entre el grupo constituido por quimioquina de ligando EBI-1 (ELC), quimioquina de órgano linfoide secundario (SLC), quimioquina expresada en el timo (TECK), quimioatrayente de linfocito B (BLC), quimioquina atrayente de célula T cutánea (CTACK), proteína-I? inflamatoria de macrófagos murinos (mMIP-I?) y proteína II inflamatoria de macrófagos (vMIPII); y

(b) comparar el nivel de unión de la quimioquina y el polipéptido CCX CKR en (a) con el nivel de unión en ausencia del compuesto de ensayo;

en el que una reducción de la unión indica que el compuesto de ensayo es un inhibidor de la unión, e indicando un incremento que el compuesto de ensayo es un intensificador de la unión.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicha puesta en contacto comprende poner en contacto una célula que expresa el polipéptido CCX CKR.

3. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la quimioquina se encuentra marcada.

4. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el compuesto de ensayo se encuentra marcado.

5. Procedimiento según la reivindicación 3 ó 4, en el que el marcaje se selecciona de entre el grupo constituido por un fluoróforo, un agente quimioluminiscente, un marcaje isotópico y una enzima.

6. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el polipéptido CCX CKR forma parte de una fracción celular.

7. Procedimiento para la identificación de un modulador de la actividad de CCX CKR, que comprende:

(a) poner en contacto una célula que expresa un polipéptido CCX CKR con un compuesto de ensayo en presencia de una quimioquina; en el que:

el polipéptido CCX CKR, (i) comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº 2, o es un fragmento o variante de la misma, en el que la variante presenta una identidad de secuencias de por lo menos 90% respecto de la secuencia SEC ID nº 2, e (ii) puede unirse a la quimioquina en ausencia del compuesto de ensayo; y

la quimioquina se selecciona de entre el grupo constituido por quimioquina de ligando EBI-1 (ELC), quimioquina de órgano linfoide secundario (SLC), quimioquina expresada en el timo (TECK), quimioatrayente de linfocitos B (BLC), quimioquina atrayente de células T cutáneas (CTACK), proteína-I? inflamatoria de macrófagos murinos (mMIP-I?) y proteína II inflamatoria de macrófagos víricos (vMIPII); y

(b) detectar la modulación de la actividad biológica en presencia del compuesto de ensayo, en el que la modulación de la actividad biológica indica que un compuesto de ensayo es un modulador de la actividad de CCX CKR, y en el que la actividad biológica es un cambio de la concentración de calcio citosólico libre o de la quimotaxis.

8. Procedimiento según la reivindicación 7, en el que el polipéptido CCX CKR es un polipéptido recombinante.

9. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 7, en el que la quimioquina es ELC.

10. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 7, en el que la quimioquina es SLC.

11. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 7, en el que la quimioquina es TECK.

12. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 7, en el que la quimioquina es BLC.

13. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 7, en el que la quimioquina es CTACK.

14. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 7, en el que la quimioquina es mMIP-I?.

15. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 7, en el que la quimioquina es vMIPII.

16. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 7, en el que la variante presenta una identidad de secuencia de por lo menos el 95% respecto de la secuencia SEC ID nº 2, o en el que la variante presenta una identidad de secuencia de por lo menos el 98% respecto de la secuencia SEC ID nº 2.