Una proteína conjugada de Sso7-polimerasa que comprende un dominio Sso7 que tiene una identidad de al menos el 60% con la SEC ID Nº 2 unido a un dominio polimerasa;

en la que un aminoácido en una posición del dominio Sso7 que es una posición de resto superficial según se determina con respecto a la SEC ID Nº 2 se sustituye con un resto aminoacídico diferente, en el que los restos superficiales son restos expuestos en la superficie del dominio Sso7 que interacciona con el ADN;

en el que la sustitución del resto superficial da como resultado una capacidad de procesamiento que es inferior a la capacidad de procesamiento de una fusión de Sso7-polimerasa de tipo silvestre y superior a la capacidad de procesamiento del dominio polimerasa cuando no está fusionado a un dominio Sso7

Proteínas conjugadas de Sso7-polimerasa mejoradas.

Antecedentes de la invención

La actividad de una polimerasa puede mejorarse uniendo un dominio de unión a ácido nucleico bicatenario inespecífico de secuencia a la enzima, o su dominio catalítico (véase, por ejemplo, el documento WO0192501). Dichas polimerasas modificadas presentan una capacidad de procesamiento mejorada en comparación con las enzimas no modificadas. En algunos casos, sin embargo, puede ser útil modificar adicionalmente la capacidad de procesamiento de estas polimerasas mejoradas. Por ejemplo, cuando se realizan reacciones en cadena de la polimerasa (PCR) para moldes largos, el uso de polimerasas de alta capacidad de procesamiento con frecuencia da como resultado menores rendimientos. Por lo tanto, existe la necesidad de modular la capacidad de procesamiento de polimerasa para optimizar la enzima para fines específicos, por ejemplo PCR larga.

Además, la modificación de polimerasa con un dominio de unión a ácido nucleico bicatenario inespecífico de secuencia puede en algunos casos disminuir la discriminación de la polimerasa entre cebadores/moldes emparejados erróneamente y cebador/molde emparejado apropiadamente. Por lo tanto, también puede existir la necesidad de aumentar la especificidad de una polimerasa por el molde de cebador.

La presente invención aborda ambas necesidades, es decir, la necesidad de modular la capacidad de procesamiento y la especificidad de unión a cebador/molde. La invención proporciona un conjugado de polimerasa que comprende un dominio de unión a ADN mutado tal como Sso7d, Sac7d o dominios relacionados unidos a la polimerasa o al dominio catalítico de la polimerasa. El dominio de unión mutado comprende una o más sustituciones de aminoácidos en un resto de superficie de la secuencia polipeptídica del dominio de unión a ADN. Estas polimerasas de fusión sustituidas presentan capacidades de rendimiento aumentadas en reacciones de polimerasas, por ejemplo, una reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

Breve sumario de la invención

Esta invención proporciona polimerasas que tienen una capacidad de procesamiento modulada. En algunas realizaciones, la polimerasa también presenta una especificidad de unión cebador/molde aumentada. En particular, la invención proporciona una proteína conjugada de Sso7 polimerasa que comprende un dominio Sso7 que tiene una identidad de al menos el 60% con la SEC ID Nº: 2 unida a un dominio polimerasa; en la que un aminoácido en una posición del dominio Sso7 que es una posición de resto de superficie según se determinó con respecto a la SEC ID Nº: 2 se sustituye con un resto aminoacídico diferente, en el que los restos superficiales son restos expuestos en la superficie del dominio Sso7 que interacciona con el ADN; en el que la sustitución del resto superficial da como resultado una capacidad de procesamiento que es inferior a la capacidad de procesamiento de una fusión de Sso7-polimerasa de tipo silvestre y superior a la capacidad de procesamiento del dominio polimerasa cuando no está fusionado con un dominio Sso7d. Con frecuencia, la sustitución del resto superficial también aumenta la especificidad de unión a cebador/molde de polimerasa en comparación con una proteína de fusión de Sso7-polimerasa que comprende la SEC ID Nº: 2.

En algunas realizaciones, la posición de resto superficial se selecciona del grupo que consiste en un resto triptófano en posición 24, un resto valina en posición 26 y un resto metionina en posición 29. En realizaciones particulares, la posición de resto superficial es un resto triptófano en posición 24 y el resto aminoacídico de sustitución es cualquier aminoácido distinto de Asp, Glu, Arg, Lys o Pro. Con frecuencia, el resto aminoacídico de sustitución es glicina, valina o alanina.

En realizaciones preferidas, el dominio polimerasa de los conjugados tiene una actividad polimerasa térmicamente estable. El dominio polimerasa puede ser un dominio polimerasa de familia A, por ejemplo un dominio polimerasa de Thermus o un dominio polimerasa de familia B, por ejemplo, un dominio polimerasa de Pyrococcus. Con frecuencia, el dominio de polimerasa es un dominio de ?Taq polimerasa.

En otras realizaciones, el dominio Sso7 comprende la SEC ID Nº: 2, en la que un aminoácido en una posición que es una posición de resto superficial se sustituye por un aminoácido diferente. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el dominio Sso7 comprende la SEC ID Nº: 2, en la que un resto triptófano en posición 24 se sustituye con un resto aminoacídico seleccionado de un grupo que consiste en glicina, alanina y valina.

En otro aspecto, la invención proporciona un método de realización de una reacción de polimerasa en un ácido nucleico diana presente en una solución, comprendiendo el método: (a) poner en contacto el ácido nucleico diana con una proteína conjugada de Sso7-polimerasa como se ha descrito anteriormente; en el que la solución es de una composición que permite que el dominio de unión se una al ácido nucleico diana y el dominio polimerasa extienda un cebador que hibride con la secuencia de ácido nucleico diana; y (b) incubar la solución en condiciones en las que el cebador se extiende por la polimerasa.

La descripción también proporciona métodos de preparación y uso de los conjugados de polimerasa descritos en este documento para modular una reacción de polimerasa.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 representa los resultados de una reacción de PCR que compara Sso7d(G)-?Taq con la proteína de fusión de tipo silvestre Sso7d-?Taq. Los productos de PCR finales se analizaron en un gel de agarosa al 1% para evaluar los rendimientos relativos.

La Figura 2 muestra un alineamiento de Sac7e (SEC ID Nº: 10) y Sso7 (SEC ID Nº: 9). Péptidos de consenso = SEC ID Nº: 11-14.

Descripción detallada de la invención

Definiciones

Las expresiones "Sso7" o "dominio de unión de ADN Sso7" o "dominio de unión a ADN tipo Sso7" se refieren a variantes polimórficas, alelos, mutantes y homólogos interespecie de polipéptido y ácido nucleico que: (1) tienen una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de aminoácidos superior a aproximadamente el 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, preferiblemente 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% o una identidad de secuencias de aminoácidos superior, preferiblemente sobre una región de al menos aproximadamente 15, 25, 35, 50 o más aminoácidos con la secuencia de Sso7 de la SEC ID Nº: 2; (2) se unen a anticuerpos, por ejemplo anticuerpos policlonales generados contra un inmunógeno que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 2 y variantes modificadas de forma conservativa de la misma; (3) hibridan específicamente en condiciones de hibridación rigurosas con una secuencia de ácido nucleico de Sso7 de la SEC ID Nº: 1 y variantes modificadas de forma conservativa de la misma; (4) tienen una secuencia de ácido nucleico que tiene una identidad de secuencia de nucleótidos superior a aproximadamente el 50%, preferiblemente superior a aproximadamente el 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99%, preferiblemente sobre una región de al menos aproximadamente 50, 100, 150 o más nucleótidos con la SEC ID Nº: 1; o (5) se amplifican por cebadores que hibridan específicamente en condiciones de hibridación rigurosas con la misma secuencia que un conjunto de cebadores tal como 5'GCAACAGTAAAGTTCAAGTACAAAGG 3' (SEC ID Nº: 15) (directo) y 5' CTAACATTTGTAGTAGTTCTTTTGGAGCG 3' (SEC ID Nº: 16), (inverso). El término influye tanto polipéptidos Sso7 de longitud completa como fragmentos de los polipéptidos que tienen actividad de unión a ADN bicatenario inespecífica de secuencia.

El término "dominio" se refiere a una unidad de una proteína o complejo proteico que comprende una subsecuencia polipeptídica, una secuencia polipeptídica completa o una pluralidad de secuencias polipeptídicas en las que la unidad tiene una función definida. La función se entiende que está definida ampliamente y puede ser unión al ligando, actividad catalítica o puede tener un efecto estabilizante sobre la estructura de la proteína.

El término "idéntico" en el contexto de dos secuencias de ácidos nucleicos o polipeptídicas se refiere a los restos en las dos secuencias que son iguales cuando se alinean para una correspondencia máxima, según se mide usando "algoritmos de comparación de secuencias" descritos en la sección a continuación titulada "Identificación de dominios Sso7 basándose en la homología".

Un...

1. Una proteína conjugada de Sso7-polimerasa que comprende un dominio Sso7 que tiene una identidad de al menos el 60% con la SEC ID Nº 2 unido a un dominio polimerasa;

en la que un aminoácido en una posición del dominio Sso7 que es una posición de resto superficial según se determina con respecto a la SEC ID Nº 2 se sustituye con un resto aminoacídico diferente, en el que los restos superficiales son restos expuestos en la superficie del dominio Sso7 que interacciona con el ADN;

en el que la sustitución del resto superficial da como resultado una capacidad de procesamiento que es inferior a la capacidad de procesamiento de una fusión de Sso7-polimerasa de tipo silvestre y superior a la capacidad de procesamiento del dominio polimerasa cuando no está fusionado a un dominio Sso7.

2. La proteína conjugada de Sso7-polimerasa de la reivindicación 1, en la que el resto superficial en posición Trp24, Val26, Met29, Ser31, Arg43 o Ala45 del dominio Sso7 se sustituye.

3. La proteína conjugada de Sso7-polimerasa de la reivindicación 2, en la que el resto superficial en la posición Trp24, Val26 o Met29 del dominio Sso7 se sustituye.

4. La proteína conjugada de Sso7-polimerasa de la reivindicación 1, 2 ó 3, en la que la sustitución del resto superficial aumenta la especificidad de unión de cebador/molde de polimerasa en comparación con una proteína de fusión de Sso7-polimerasa que comprende la SEC ID Nº 2.

5. La proteína conjugada de Sso7-polimerasa de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el dominio Sso7 comprende la SEC ID Nº 2 en la que un aminoácido en una posición que es una posición de resto superficial se sustituye por un aminoácido diferente.

6. La proteína conjugada de Sso7-polimerasa de la reivindicación 2, en la que el resto superficial en posición Trp24 se sustituye por cualquier aminoácido distinto de Asp, Glu, Arg, Lys y Pro.

7. La proteína conjugada de Sso7-polimerasa de la reivindicación 6, en la que la sustitución de resto aminoacídico se selecciona de glicina, valina y alanina.

8. La proteína conjugada de Sso7-polimerasa de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores en la que el dominio polimerasa tiene una actividad polimerasa térmicamente estable.

9. La proteína conjugada de Sso7-polimerasa de la reivindicación 8, en la que el dominio polimerasa es un dominio polimerasa de la familia A o miembro de la familia B de polimerasa.

10. La proteína conjugada de Sso7-polimerasa de la reivindicación 9, en la que el dominio polimerasa de la familia A comprende un dominio ?Taq polimerasa.

11. La proteína conjugada de Sso7-polimerasa de la reivindicación 9, en la que el miembro de la familia B de polimerasa comprende un dominio polimerasa de Pyrococcus.

12. La proteína conjugada de Sso7-polimerasa de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el dominio Sso7 tiene una identidad de al menos el 75% con la SEC ID Nº 2.

13. La proteína conjugada de Sso7-polimerasa de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el dominio Sso7 tiene una identidad de al menos el 90% con la SEC ID Nº 2.

14. Un método de realización de una reacción de polimerasa en un ácido nucleico diana presente en una solución, comprendiendo el método: