Una polimerasa híbrida que tiene actividad polimerasa, donde la polimerasa tiene una identidad de al menos 94% con una secuencia de aminoácidos seleccionada entre los SEQ ID NO:

2, SEQ ID NO: 12, los aminoácidos 1 a 775 del SEQ ID NO: 6, los aminoácidos 1 a 775 del SEQ ID NO: 8 y los aminoácidos 1 a 775 del SEQ ID NO: 10; donde la polimerasa híbrida comprende posiciones que están mutadas a partir del residuo nativo del SEQ ID NO: 24 o el SEQ ID NO: 25 al correspondiente residuo del SEQ ID NO: 25 o el SEQ ID NO: 24 respectivamente; y tiene una razón de actividad polimerasa con respecto a exonucleasa incrementada en relación con la polimerasa Pfu parental

Métodos de producción de polimerasas híbridas y composiciones.

Campo de la invención

Esta invención se refiere a métodos para facilitar la evolución de proteínas y a los polipéptidos novedosos obtenidos utilizando los métodos.

Antecedentes de la invención

Esta invención se refiere a métodos para crear proteínas híbridas para identificar proteínas con una actividad mejorada. Se conocen numerosos métodos para generar secuencias híbridas para potenciar la función de una proteína (véase, p. ej., la Patente de los Estados Unidos Núm. 6.132.970). No obstante, estos métodos cuentan con las técnicas recombinatorias que barajan las secuencias para crear nuevas proteínas. Existe la necesidad adicional de facilitar la identificación de proteínas con una función mejorada. Esta invención trata esa necesidad y adicionalmente, proporciona polipéptidos, p. ej., polimerasas, que son obtenidas utilizando el método.

Las polimerasas catalizan la formación de polímeros biológicos. Las polimerasas son útiles para la síntesis de ADN a partir de desoxirribonucleósidos trifosfato en presencia de un molde de ácido nucleico y un cebador de ácido nucleico; la síntesis de ARN a partir de ribonucleótidos y un molde de ADN o ARN; la replicación y reparación del ADN; y la amplificación de ADN o ARN in vitro.

La actividad exonucleasa 3' a 5', comúnmente referida como actividad "correctora", es una importante característica de algunas ADN polimerasas y está presente en polimerasas de la familia B de especies de Pyrococcus tales como PolI de Pyrococcus furiosus (referida en la presente memoria como "Pfu" y descrita en la Patente de los Estados Unidos 5.948.663; asequible comercialmente de Stratagene, San Diego, CA) y PoliI de la cepa Pyrococcus GB-D (referida en la presente memoria como "Deep Vent®" y descrita en la Patente de los Estados Unidos 5.834.285; asequible comercialmente de New England Biolabs, Beverly MA). La función esencial de la exonucleasa 3' a 5' es reconocer y escindir un extremo sin bases emparejadas. Las enzimas con una elevada actividad exonucleasa, sin embargo, no se utilizan comúnmente en reacciones que cuentan con la actividad polimerasa debido a que tienen una escasa capacidad de procesamiento. Por ejemplo, si se utiliza en la PCR, a menudo es combinada con la ADN PolI de Thermus aquaticus, (Taq), una enzima con una capacidad de procesamiento superior pero sin actividad exonucleasa 3' a 5', con el fin de mejorar la fidelidad de la reacción de PCR. La capacidad de procesamiento mejorada en las polimerasas con una elevada actividad exonucleasa 3' a 5' aumentaría enormemente la fiabilidad de las reacciones que cuentan con el uso de polimerasas y eliminaría, en algunos casos, la necesidad de polimerasa Taq. Por consiguiente, existe la necesidad de crear polimerasas mejoradas con actividad exonucleasa 3' a 5'.

En el documento WO 01/92501 se informa de una fusión de un dominio de unión de ácido nucleico de secuencia no específica a una enzima modificadora de ácido nucleico con el fin de intensificar la capacidad de la enzima para unirse a y modificar el ácido nucleico. El documento WO 01/61015 describe polimerasas de ácido nucleico quiméricas construidas utilizando dominios enzimáticamente activos aislados de diferentes proteínas.

El número de acceso Uniprot Q9HH98 registra una secuencia de un fragmento de ADN polimerasa de Pyrococcus sp. (cepa ST700). En el documento US 5.489.523 se describe una ADN polimerasa de Pyrococcus furiosus termoestable recombinante carente de actividad exonucleasa 3' a 5'. Evans et al. (2000) Nucleic Acids Research 28: 1059-1066 informan sobre mutaciones en un gen que codifica la ADN polimerasa de la familia PolII de Pyrococcus furiosus para intentar mejorar la utilización de ddNTP.

Esta invención se dirige a esta y otras necesidades proporcionando composiciones de polimerasa novedosas.

Breve resumen de la invención

Se describen en la presente memoria métodos para generar polipéptidos con una función mejorada. El método comprende crear proteínas híbridas que tienen una actividad biológica común que comprende las etapas de: (a) crear una genoteca de 32 o más ácidos nucleicos que codifican una pluralidad de miembros de proteínas híbridas, donde los miembros difieren de un grupo de al menos dos proteínas de partida con los correspondientes aminoácidos, e i) donde las proteínas de partida son proteínas homólogas que tienen una similitud por pares de aminoácidos de más del 60% entre si y que tienen al menos una actividad biológica común, ii) donde una mayoría de los miembros de la genoteca codificante tienen una similitud de aminoácidos de más del 60% con cualquiera de las proteínas de partida, y iii) donde la mayoría de las diferencias entre los miembros de la genoteca codificada y las proteínas de partida están restringidas a aquellas que corresponden a los aminoácidos que difieren entre las proteínas de partida; (b) expresar la proteína a partir de al menos un miembro de la genoteca para crear al menos una proteína híbrida; y (c) seleccionar al menos una proteína que tiene una actividad biológica común de las proteínas de partida.

Asimismo se describe en la presente memoria una genoteca de ácidos nucleicos que codifican una pluralidad de miembros de proteínas híbridas, donde los miembros difieren de un grupo de al menos dos proteínas de partida con los correspondientes aminoácidos, e i) donde las proteínas de partida son proteínas homólogas que tienen una similitud en la secuencia de aminoácidos de más del 60% entre si y que tienen al menos una actividad biológica común, ii) donde la mayoría de los miembros de la genoteca tienen una similitud de aminoácidos de más del 60% con cualquiera de las proteínas parentales, y iii) donde la mayoría de las diferencias entre los miembros de la genoteca y las proteínas de partida están restringidas a aquellas que corresponden a los aminoácidos que difieren de las proteínas de partida. Las proteínas parentales pueden ser enzimas, p. ej., polimerasas, enzimas biosintéticas y catabólicas. Las enzimas parentales también pueden ser isozimas. Las proteínas parentales también pueden ser proteínas no enzimáticas, p. ej., proteínas que se unen a otra molécula, con o sin efecto alostérico, tales como hormonas, receptores, anticuerpos y similares. A menudo, las proteínas parentales tienen una similitud de aminoácidos de más del 80% entre sí y la mayoría de los miembros de la genoteca tienen una similitud de aminoácidos de más del 80% con cualquiera de las proteínas de partida.

Una proteína híbrida sintética puede comprender una similitud de aminoácidos de más del 60% entre cada miembro de un grupo de al menos dos proteínas de partida, donde cada proteína de partida del grupo comparte una similitud de aminoácidos de más del 60% y al menos una actividad biológica común con cada miembro del grupo, y donde la proteína híbrida: (a) comparte al menos una actividad biológica con todos los miembros del grupo; (b) tiene un mínimo de 5 diferencias de residuos de aminoácido con cualquier miembro del grupo; y (c) comprende no más del 24% de aminoácidos que no corresponden a ningún miembro del grupo.

Las proteínas parentales de partida pueden ser enzimas, p. ej. polimerasas. Las proteínas parentales también pueden ser isozimas.

A menudo, las proteínas parentales tienen una similitud de más del 80% con cada una de las otras y la mayoría de los miembros de la genoteca tienen una similitud de más del 80% con cualquiera de las proteínas parentales. Proteína híbrida.

El grupo de proteínas parentales puede comprender la ADN polimerasa de la familia B de Pyrococcus furiosus (Pfu) y la ADN Polimerasa Deep Vent® y las diferencias entre cada miembro del grupo pueden comprender al menos 10 de los emparejamientos erróneos seleccionados del grupo mostrado en la Figura 2.

La invención se refiere a la generación de polipéptidos híbridos que comprenden alteraciones en regiones menos conservadas de las proteínas parentales y, sorprendentemente, proporciona proteínas híbridas que presentan una mejora en las propiedades deseadas con respecto a las proteínas parentales. Se puede diseñar una proteína de la invención como una proteína híbrida alterada de residuos variables (VRAHP), como se describe en términos generales. Más específicamente, una VRAHP contiene alteraciones en posiciones no conservadas...

1. Una polimerasa híbrida que tiene actividad polimerasa, donde la polimerasa tiene una identidad de al menos 94% con una secuencia de aminoácidos seleccionada entre los SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 12, los aminoácidos 1 a 775 del SEQ ID NO: 6, los aminoácidos 1 a 775 del SEQ ID NO: 8 y los aminoácidos 1 a 775 del SEQ ID NO: 10; donde la polimerasa híbrida comprende posiciones que están mutadas a partir del residuo nativo del SEQ ID NO: 24 o el SEQ ID NO: 25 al correspondiente residuo del SEQ ID NO: 25 o el SEQ ID NO: 24 respectivamente; y tiene una razón de actividad polimerasa con respecto a exonucleasa incrementada en relación con la polimerasa Pfu parental.

2. La polimerasa híbrida de la reivindicación 1, donde la polimerasa híbrida comprende la secuencia de aminoácidos de los SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 12, los aminoácidos 1 a 775 del SEQ ID NO: 6, los aminoácidos 1 a 775 del SEQ ID NO: 8 o los aminoácidos 1 a 775 del SEQ ID NO: 10.

3. La polimerasa híbrida de la reivindicación 1, donde la polimerasa híbrida tiene una identidad de al menos 94% con la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 2.

4. La polimerasa híbrida de la reivindicación 3, que comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 2.

5. La polimerasa híbrida de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende adicionalmente un dominio de unión a ADN que está conjugado con la polimerasa.

6. La polimerasa híbrida de la reivindicación 5, donde la polimerasa está conjugada con un dominio de unión a ADN que comprende una proteína de unión a ADN básica pequeña Arqueal.

7. La polimerasa híbrida de la reivindicación 6, donde el dominio de unión a ADN básico pequeño Arqueal es Sso7d, Sac7d o Sac7e.

8. La polimerasa híbrida de la reivindicación 7, donde la polimerasa está conjugada con Sso7d para formar un producto conjugado de polimerasa Sso7d.

9. La polimerasa híbrida de la reivindicación 8, donde el producto conjugado de polimerasa Sso7d comprende la secuencia de aminoácidos de los SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 o SEQ ID NO: 14.

10. Un ácido nucleico aislado que codifica una polimerasa híbrida como se muestra en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.

11. Un vector de expresión que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 10.

12. Una célula anfitriona transfectada con el vector de la reivindicación 11.

13. Un método de amplificación de una secuencia diana que utiliza una polimerasa híbrida, comprendiendo el método las etapas de:

(a) proporcionar una polimerasa de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9;

(b) combinar la polimerasa en una mezcla de reacción de amplificación; y

(c) amplificar la secuencia diana.