Antígeno de gliadina recombinante desamidada.

Un antígeno para detectar la enfermedad celíaca, que comprende una gliadina recombinante desamidada quecomprende un dímero o trímero de SEC ID NO:

1, en el que la gliadina recombinante desamidada está unidacovalentemente a una etiqueta formando una proteína de fusión de gliadina, en la que la etiqueta está inmovilizadasobre un soporte sólido.

DESCRIPCIÓN

Antígeno de gliadina recombinante desamidada.

Referencias cruzadas a solicitudes relacionadas.

La presente solicitud reivindica el beneficio de prioridad respecto de la solicitud de patente U.S. nº. 61/046693, presentada el 21 de abril de 2008.

Antecedentes de la invención La enfermedad celíaca (CD) es una enfermedad gastrointestinal grave que tiene un componente genético fuerte. La CD se caracteriza por una intolerancia permanente de las proteínas de trigo, cebada, centeno y avena. Aunque no se conoce completamente la fisiopatología de la CD, está claro que la presencia de las proteónas tóxicas en la dieta de los pacientes causa una lesión total o parcial de la mucosa intestinal (Brandtzaeg, P. 1997, Mechanisms of gastrointestinal reactions to food. Environmental Toxicology and Pharmacology 4; 9-24) que conduce a síndromes de mala absorción causando diarrea, vómitos, dolor abdominal, anorexia, crecimiento retardado, mala nutrición y anemia. La CD se ha asociado con un mayor riesgo de cáncer intestinal en pacientes no diagnosticados y no tratados (Holmes GKT, 1989, Malignancy in coeliac disease-effect of a gluten-free diet, Gut 30; 333-338) . La CD afecta principalmente a niños menores de tres años, pero es también común en adultos y a veces es clínicamente atípica o asintomática (Ferguson A y otros, 1992, Definitions and diagnostic criteria of latent and potential coeliac disease. Ed. por Aurricchio S. Visakorpi J.K., en Epidemiology of CD. Dyn Nutr Res, Basel, Karger 2; 119-127) . La CD es más frecuente en pacientes con otra enfermedad genética o autoinmuune, como diebetes mellitus insulinodependiente, síndrome de Down, deficiencia selectiva de IgA y dermatitis herpetiformis (Sirgus N y otros, 1993. Prevalence of coeliac disease in diabetic children and adolescents in Sweeden. Acta Pediatr 66; 491-494; Zubillaga P y otros, 1993. Down syndrome and coeliac disease. J. Pediatr Gastroenterol Nutr 16: 168-171; Boyce N 1997) .

Los síntomas clínicos de CD podrían confundirse con los producidos por otras enfermedades gastrointestinales. En estos casos, la CD es mal diagnosticada y los pacientes no reciben el tratamiento específico, esto es, una eliminación completa de gluten en la dieta. Por otra parte, si un paciente no celíaco es diagnosticado erróneamente como celíaco, tendría una innecesaria dieta exenta de gluten durante toda su vida. Consecuentemente es esencial un diagnóstico preciso de la CD. Actualmente, la norma para el diagnóstico de la CD es la biopsia intestinal, repetida tres veces: a la aparición de los síntomas clínicos, después de varios meses de dieta exenta de gluten y después de un reto con gluten.

A causa de que la biopsia intestinal es un método invasivo y se han desarrollado ensayos serológicos precisos, se ha revisado el criterio anterior (Walker-Smidi y otros, 1990. Revised criteria for diagnosis of coeliac disease. Report of Working group of European Society of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. Archiv Dis Child 65:909-911) . Actualmente se pueden realizar ensayos serológicos a la aparición de síntomas clínicos y, cuando son positivos, está indicado una biopsia intestinal confirmativa. La respuesta al tratamiento con una dieta exenta de gluten se puede seguir por ensayos serológicos. Si hay discrepancias entre la respuesta clínica al tratamiento y el resultado de los ensayos serológicos, estaría indicada una segunda biopsia intestinal. Se han desarrollado varios ensayos serológicos para la diagnosis de la enfermedad celíaca, como la detección de anticuerpos para antígenos celulares,

o anticuerpos para antígenos de alimentos, como las gliadinas. Hay kits diagnósticos para la detección de: anticuerpos endomisiales, anticuerpos antirreticulina, anticuerpos antigliadina y anticuerpos transglutaminasa antitejido.

Los anticuerpos antigliadina (AGA) se han usado extensamente para el diagnóstico serológico de CD (Stern M y otros, Validation and standardization of serological screening tests for coeliac disease in 1996. 3rd EMRC/ESPGAN Workshop, 1996, 5-8 dic., 1996, Molsheim, Francia, págs. 9-24; Catassi C y otros, 1999, Quantitative antigliadin tibody measurements in clinical practice; an italian multicenter study. Ital J Gastroenterol Hepatol 31; 366-370) . Los AGA se detectan principalmente por ELISA (ensayo inmunoabsorbente ligado a una enzima) , método más simple, más objetivo que IFA (análisis de anticuerpos inmunofluorescente indirecto) , y se puede usar para el análisis de un gran número de muestras. Sin embargo, los AGA son menos específico para CD que los anticuerpos endomisales (EMA) y la detección de anticurpos para isotipos de IgA o IgG requiere dos ensayos independientes. Recientemente se ha dado cuenta de un inmunoensayo visual para la detección de AGA que resuelve algunos de estos problemas (Garrote JA, Sorell L, Alfonso P y otros 1999. A simple visual immunoassay for the screening of coeliac disease. Eur. J Clin Invest 29; 697-699; Oficina Española de Patentes y Marcas nº. 9801067) .

En 1997, Districh y otros identificaron transglutaminasa de tejido (tTG) , una proteína de 85 kDa, como el principal autoantígeno detectado por anticuerps antiendomisales (Dietrich W y otros 1997. Identification of tissue transaminase as the autoantigen of coeliac disease. Nat Med 3:797-801) . Se ha dado cuenta útimamente de la detección de anticuerpos anti-tTG en formatos ELISA o radioligando (RLA) basados en tTG de extractos de hígado de cobaya o tTG humana recombinante clonados de diferentes tejidos (Sulkanen S y otros 1998. Tissue transglutaminase antiantibody enzyme-linked immunosorbent assay in detecting celiac disease. Gastroenterology 115:1322-1328; Siessler J. y otros, 1999. Antibodies to human recombinant tissue transaminase measured by radioligand assay: Evidence for high diagnostic sensitivity for celiac disease. Horm Metab Res 31; 375-379) .

Los procedimientos de la técnica anterior para la detección de la enfermedad celíaca usan epitopos de gliadina o piezas de la proteína de gliadina en un ensayo que condujo a negativos falsos y positivos falsos. Lo que se necesita es un ensayo que proporcione nuevos antígenos que contienen un conjunto de epitopos más inclusivo que proporcione un ensayo más preciso para la enfermedad celíaca. Sorprendentemente, la presente invención satisface ésta y otras necesidades.

Sumario de la invención En un aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento para determinar si un sujeto sufre la enfermedad celíaca poniendo en contacto una muestra de fluido corporal del sujeto con un antígeno formado a partir de una proteína de fusión de gliadina inmoviizada sobre un soporte sólido. La proteína de fusión del antígeno incluye una gliadina recombinante desamidada unida a una etiqueta tal como proteína de glutationa-S-transferasa (GST) . El antígeno se prepara por inmovilización sobre el soporte sólido de la proteína de fusión de gliadina por la vía de la etiqueta. El antígeno puede incluir además transglutaminasa tisular (tTG) unida por cruce a la proteína de fusión de gliadina. Cuando está presente tTG, la tTG y la gliadina recombínante desamidada se mezclan antes de la inmovilización sobre la fase sólida.

El estado actual de los procedimientos de la técnica para detectar la enfermedad celíaca se utiliza gliadina recombinante y natural, péptidos de gliadina, péptidos de gliadina desaminada o transglutaminasa de tejido como antígenos para la detección de los correspondientes anticuerpos. Se ha sugerido que la gliadina desamidada, tTG y un complejo de gliadina desamidada y tTG son los antígenos del estado de la enfermedad que son presentados por células T para la generación de anticuerpos. Se sabe que la presencia de anticuerpos para la gliadina natural no es una enfermedad específica, lo que es puesto en evidencia por la presencia de anticuerpos de IgG antiglandina muy prevalentes en pacientes sanos. La gliadina no es una proteína homogénea sino, más bien, una clase de proteínas cuyas secuencias varían según las especies (trigo, centeno y cebada) y la cepa, e incluso dentro de una cepa. Como resultado, los ensayos corrientes o no poseen un repertorio de epitopos completo (por ejemplo, péptidos de gliadina desamidada sintéticos o recombinantes) o generan resultados positivos falsos cuando se usa el antígeno recombinante desamidado. La presente invención se dirige a las deficiencias de los procedimientos de la técnica anterior por combinación de una proteína de gliadina recombinante desamidada con una etiqueta inmovilizada sobre un soporte sólido.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un antígeno para detectar la enfermedad celíaca, antígeno que incluye una gliadina recombinante desamidada... [Seguir leyendo]

1. Un antígeno para detectar la enfermedad celíaca, que comprende una gliadina recombinante desamidada que comprende un dímero o trímero de SEC ID NO:1, en el que la gliadina recombinante desamidada está unida covalentemente a una etiqueta formando una proteína de fusión de gliadina, en la que la etiqueta está inmovilizada sobre un soporte sólido.

2. El antígeno de la reivindicación 1, en el que la etiqueta está seleccionada entre una glutationa S-transferasa (GST) y una etiqueta his, preferiblemente

(i) la etiqueta es GST, o

(ii) el antígeno comprende además transaminasa tisular (tTG) formando un complejo tTG-proteína de fusión de gliadina.

3. El antígeno de la reivindicación 2, en el que la tTG y la proteína de fusión de gliadina están unidas por un reticulador, reticulador que preferiblemente es un miembro seleccionado entre un reticulador heterobifuncional y un reticulador homobifuncional.

4. El antígeno de la reivindicación 3, en el que el reticulador es un reticulador homobifuncional, reticulador que preferiblemente está seleccionado entre el grupo que consiste en bis (sulfosuccinimidil) suberato (BS3) , bis[succinimidilsuccinato] de etilenglicol (EGS) , bis[sulfosuccinimidilsuccinato] de etilenglicol (sulfo-EGS) , bis[2 (succinimidooxicarboniloxi) etil]sulfona (BSOCOES) , ditiobis (succinimidil) propionato (DSP) , 3, 3’-ditiobis (sulfosuccinimidilpropionato) (DTSSP) , suberato de disuccinimidilo (DSS) , glutarato de disuccinimidilo (DSG) , Nsuccinimidiladipato de metilo, (MSA) , tartrato de disuccinimidilo (DST) , 1, 5-difluoro-2, 4-dinitrobenceno (DFDNB) , hidrocloruro de 1-etil-3-[3-dimetilaminopropil]carbodiimida (EDC o EDAC) , sulfosuccinimidil-4- (N-maleimidometil) ciclohexano-1-carboxilato (sulfo-SMCC) , N-hidroxisulfosuccinimida (sulfo-NHS) , hidroxilamina y sulfo-LC-SPDP (N-succinimidil 3- (2-piridil) ditio) propionato y sulfosuccinimidil 6- (3’-[2-piridilditio]-propionamido) hexanoato (sulfo-LC-SPDP) , más preferentemente, el reticulador es bis (sulfosuccinimidil) suberato (BS3) .

5. El antígeno de la reivindicación 1, en el que

(i) la gliadina recombinante desamidada tiene como mínimo una identidad de 95% con SEC ID NO:1, o

(ii) la gliadina recombinante desamidada es la SEC ID NO:2.

6. Un antígeno para detectar la enfermedad celiaca preparado por el procedimiento que comprende:

(a) poner en contacto un soporte sólido con una proteína de fusión de gliadina, en el que la proteína de fusión de gliadina comprende una gliadina recombinante desamidada que comprende un dímero o trímero de la SEC ID NO:1, estando unida la diamina recombinante desamidada covalentemente a una etiqueta, de manera que la proteína de fusión de gliadina está inmovilizada sobre el soporte sólido mediante la etiqueta, preparando así el antígeno para detectar la enfermedad celíaca.

7. El antígeno de la reivindicación 6, en el que la etiqueta está seleccionada entre una glutationa S-transferasa y una etiqueta his.

8. El antígeno de la reivindicación 6, en el que el procedimiento comprende además poner en contacto la proteína de fusión de gliadina con una transaminasa tisular (tTG) , antes de la etapa (a) de poner en contacto, para formar la proteína de fusión de gliadina y la tTG.

9. El antígeno de la reivindicación 8, en el que el procedimiento comprende además (b) poner en contacto el antígeno con un reticulador para reticular la proteína de fusión de gliadina a la tTG.

10. Procedimiento para determinar si un sujeto sufre la enfermedad celíaca, procedimiento que comprende:

(a) poner en contacto una muestra de fluido corporal del sujeto con el antígeno de la reivindicación 1, y

(b) detectar cualquier anticuerpo que se haya unido específicamente al antígeno, como una indicación de la presencia de la enfermedad celíaca en el sujeto.

11. El procedimiento de la reivindicación 10, en el que

(i) la muestra es una muestra de sangre, o

(ii) la etapa de detección se realiza usando un ensayo seleccionado entre ELISA o RIA y un ensayo de inmunofluorescencia, o

(iii) el anticuerpo específico para el antígeno está seleccionado entre IgG e IgA.

12. Un kit que comprende el antígeno de la reivindicación 1; un reactivo de detección; y, opcionalmente, al menos un miembro seleccionado entre tampones, sales, estabilizadores e instrucciones.

13. Un ácido nucleico aislado que comprende la SEC ID NO:5.

14. Vector de expresión que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 13.

15. Una célula hospedadora que comprende el vector de expresión de la reivindicación 14.