PROCESO PARA PREPARACION DE L-AMINOACIDOS QUE UTILIZA CEPAS DE LA FAMILIA ENTEROBACTERIACEAS.

Un microorganismo recombinante de la familia Enterobacteriáceas que contiene un ORF yaaU sobreexpresado que codifica un polipéptido que está apostillado como un transportador de azúcar supuesto,

en el cual la secuencia de aminoácidos del polipéptido es idéntica al menos en un 90% a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo SEQ ID NO. 4, SEQ ID No. 6 y SEQ ID No. 8

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/EP2004/014082.

Solicitante: EVONIK DEGUSSA GMBH.

Nacionalidad solicitante: Alemania.

Dirección: RELLINGHAUSER STRASSE 1-11,45128 ESSEN.

Inventor/es: DUSCH,NICOLE.

Fecha de Publicación: .

Fecha Concesión Europea: 31 de Marzo de 2010.

Clasificación PCT:

  • C07K14/225 QUIMICA; METALURGIA.C07 QUIMICA ORGANICA.C07K PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas C07D; ipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina diones-2,5, C07D; alcaloides del cornezuelo del centeno de tipo péptido cíclico C07D 519/02; proteínas monocelulares, enzimas C12N; procedimientos de obtención de péptidos por ingeniería genética C12N 15/00). › C07K 14/00 Péptidos con más de 20 aminoácidos; Gastrinas; Somatostatinas; Melanotropinas; Sus derivados. › de Alcaligenes (G).
  • C07K14/245 C07K 14/00 […] › Escherichia (G).
  • C07K14/25 C07K 14/00 […] › Shigella (G).
  • C12N15/31 C […] › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Genes que codifican proteínas microbianas, p. ej. enterotoxinas.
  • C12P13/08 C12 […] › C12P PROCESOS DE FERMENTACION O PROCESOS QUE UTILIZAN ENZIMAS PARA LA SINTESIS DE UN COMPUESTO QUIMICO DADO O DE UNA COMPOSICION DADA, O PARA LA SEPARACION DE ISOMEROS OPTICOS A PARTIR DE UNA MEZCLA RACEMICA.C12P 13/00 Preparación de compuestos orgánicos que contienen nitrógeno. › Lisina; Acido diaminopimélico; Treonina; Valina.

Clasificación antigua:

  • C07K14/225 C07K 14/00 […] › de Alcaligenes (G).
  • C07K14/245 C07K 14/00 […] › Escherichia (G).
  • C07K14/25 C07K 14/00 […] › Shigella (G).
  • C12N15/31 C12N 15/00 […] › Genes que codifican proteínas microbianas, p. ej. enterotoxinas.
  • C12P13/08 C12P 13/00 […] › Lisina; Acido diaminopimélico; Treonina; Valina.

Fragmento de la descripción:

Proceso para preparación de L-aminoácidos que utiliza cepas de la familia Enterobacteriáceas.

Esta invención se refiere a un proceso para preparación de L-lisina, L-valina y L-treonina, que utiliza cepas recombinantes de microorganismos de la familia Enterobacteriáceas en la cual el marco de lectura abierto (ORF) designado yaaU está sobreexpresado, y a dichos microorganismos.

Técnica anterior

Los L-aminoácidos, en particular L-treonina, se utilizan en medicina humana y en la industria farmacéutica, en la industria alimentaria y, muy particularmente, en nutrición animal.

Es sabido que los L-aminoácidos se pueden preparar por fermentación de cepas de Enterobacteriáceas, en particular Escherichia coli (E. coli) y Serratia marcescens. Debido a su gran importancia, están realizándose continuamente esfuerzos para mejorar los métodos de preparación. Las mejoras metodológicas pueden referirse a medidas relacionadas con la tecnología de la fermentación, tales como la agitación o el suministro de oxígeno, o a la composición de los medios nutrientes, tales como la concentración de azúcar durante la fermentación, o el acabado de la forma del producto, por ejemplo por medio de cromatografía de intercambio iónico, o las propiedades intrínsecas de eficiencia del microorganismo propiamente dicho.

Para la mejora de las propiedades de eficiencia de estos microorganismos se utilizan métodos de mutagénesis, selección y elección de mutantes. Esto da por tanto como resultado cepas que son resistentes a antimetabolitos, tales como el análogo de treonina ácido a-amino-ß-hidroxivalérico (AHV), o auxótrofas para metabolitos de importancia reguladora, y producen L-aminoácidos tales como L-treonina.

Desde hace unos cuantos años, se han utilizado también métodos de DNA recombinante para la mejora de las cepas productoras de L-aminoácidos de la familia Enterobacteriáceas por amplificación de genes individuales de biosíntesis de aminoácidos e investigación del efecto sobre la producción. Información recopilada sobre la biología celular y biología molecular de Escherichia coli y Salmonella puede encontrarse en Neidhardt (ed): Escherichia coli and Salmonella, Cellular and Molecular Biology, 2nd edition, ASM Press, Washington, D.C., USA, (1996).

Los documentos D1-D3 describen las secuencias de aminoácidos de los polipéptidos de acuerdo con SEQ ID NO: 4, 6 y 8 de la presente solicitud, respectivamente.

D1 DATABASE UNI-PROT YAAU_ECOLI, 1 de noviembre de 1997 (1997-11-01), quadXP 002321166 quadAcceso a la base de datos No. P31679 quadResumen quadabarca una proteína hipotética yaaU de transporte de metabolitos de Escherichia coli D2 DATABASE UNI-PROT Q83Q5_SHIFL quad1 de junio de 2003 (2003-06-01), quadXP002321167 quadAcceso a la base de datos No. Q83SQ5 quadResumen quadcomprende una proteína supuesta de transporte de Shigella flexneri D3 DATABASE UNI-PROT Q8ZRW7_SALTY quad1 de octubre de 2003 (2003-10-01), quadXP002321168 quadAcceso a la base de datos no. Q8ZRW7 quadResumen quadcomprende una proteína supuesta de transporte de la familia MFS de Salmonella typhimurium.

Los documentos D4 WO 03/076637A y (D5) WO 03/008600A describen métodos para la producción de L-treonina por medio de sobreexpresión o deleción de ciertos genes.

El problema a resolver en (D4) está considerado como la provisión de un método para preparación de L-treonina por fermentación de microorganismos de la familia Enterobacteriáceas que comprenden un gen pepB sobreexpresado.

Objeto de la invención

El objeto de esta invención es proporcionar nuevas medidas para mejorar la preparación de L-aminoácidos, en particular L-treonina.

Descripción de la invención

La invención se refiere a microorganismos recombinantes de la familia Enterobacteriáceas que contienen un ORF yaaU sobreexpresado, que codifica un polipéptido que está apostillado como un transportador de azúcar supuesto, y que producen L-lisina, L-valina o L-treonina, de una manera mejorada.

En cada caso, se utilizan como punto de partida para la comparación los microorganismos que no son recombinantes para el ORF yaaU, y que no contienen cantidad alguna de ORF yaaU sobreexpresado.

Estos microorganismos recombinantes incluyen, en particular, microorganismos de la familia Enterobacteriáceas en los cuales un polinucleótido que codifica un polipéptido cuya secuencia de aminoácidos es al menos 90%, en particular al menos 95%, preferiblemente al menos 98%, al menos 99%, de modo particularmente preferible 99,7% y de modo muy particular preferible 100%, idéntico a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 6 y SEQ ID No. 8 está sobreexpresado.

Se da preferencia a secuencias de aminoácidos que son idénticas a las de SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 6 o SEQ ID No. 8.

Dichos microorganismos contienen polinucleótidos sobreexpresados seleccionados del grupo:

a) polinucleótido que tiene la secuencia de nucleótidos SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5 o SEQ ID No. 7;
b) polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos que corresponde a SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5 o SEQ ID No. 7 dentro de los límites de la degeneración del código genético;
c) secuencia de polinucleótidos que tiene una secuencia que se hibrida, en condiciones severas, con la secuencia que es complementaria a la secuencia SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5 o SEQ ID No. 7;
d) polinucleótido que tiene una secuencia SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5 o SEQ ID No. 7 que contiene mutantes sentido funcionalmente neutros,

codificando los polinucleótidos un transportador de azúcar supuesto.

La invención se refiere también a un proceso para preparar por fermentación L-lisina, L-valina o L-treonina, utilizando microorganismos recombinantes de la familia Enterobacteriáceas que, en particular, producen ya dichos L-aminoácidos y en los cuales al menos el marco de lectura abierto (ORF) que tiene la designación yaaU, o secuencias de nucleótidos que codifican su producto génico, está o están sobreexpresados.

Se da preferencia a la utilización de los microorganismos que se describen.

Cuando se mencionan L-aminoácidos o aminoácidos en lo que sigue, esto significa uno o más aminoácidos, con inclusión de sus sales, seleccionados del grupo L-asparagina, L-treonina, L-serina, L-glutamato, L-glicina, L-alanina, L-cisteína, L-valina, L-metionina, L-prolina, L-isoleucina, L-leucina, L-tirosina, L-fenil-alanina, L-histidina, L-lisina, L-triptófano, L-arginina and L-homoserina. Se prefiere particularmente L-treonina.

En este contexto, el término "intensificación" describe el aumento, en un microorganismo, de la actividad o concentración intracelular de una o más enzimas o proteínas que están codificadas por el DNA correspondiente, estando incrementado, por ejemplo, el número de copias del gen o genes, o del ORF o los ORFs, al menos en una (1) copia, haciéndose uso de un promotor fuerte enlazado operativamente al gen o de un gen o alelo u ORF que codifica una enzima o proteína correspondiente que tiene una actividad alta, y combinándose estas medidas en caso apropiado.

Un segmento de una secuencia de nucleótidos que codifica, o puede...

 


Reivindicaciones:

1. Un microorganismo recombinante de la familia Enterobacteriáceas que contiene un ORF yaaU sobreexpresado que codifica un polipéptido que está apostillado como un transportador de azúcar supuesto, en el cual la secuencia de aminoácidos del polipéptido es idéntica al menos en un 90% a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo SEQ ID NO. 4, SEQ ID No. 6 y SEQ ID No. 8.

2. Un microorganismo de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque contiene un polinucleótido sobreexpresado yaaU que se selecciona del grupo:

a) polinucleótido que tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5 o SEQ ID No. 7;
b) polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos que corresponde a SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5 o SEQ ID No. 7 dentro de los límites de la degeneración del código genético;
c) secuencia de polinucleótidos que tiene una secuencia que se hibrida, en condiciones severas, con la secuencia que es complementaria a la secuencia SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5 o SEQ ID No. 7.

3. Un microorganismo de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque el polipéptido posee una secuencia de aminoácidos que es idéntica al menos en un 95% a una de las secuencias seleccionadas del grupo SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 6 y SEQ ID No. 8.

4. Un microorganismo de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque el polipéptido posee la secuencia de aminoácidos que es idéntica en un 100% a la de SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 6 o SEQ ID No. 8.

5. Un microorganismo de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque se produce por transformación, transducción o conjugación, o una combinación de estos métodos, con un vector que contiene dicho ORF yaaU, un alelo de este ORF, o partes del mismo, y/o un promotor.

6. Un microorganismo de acuerdo con la reivindicación 1 ó 5, en el cual el número de copias del ORF yaaU o los alelos se ha incrementado al menos en 1.

7. El microorganismo de acuerdo con la reivindicación 6, caracterizado porque el aumento en el número de copias de dicho ORF yaaU en al menos 1 se consigue por integración de dicho ORF o los alelos del mismo en el cromosoma del microorganismo.

8. El microorganismo de acuerdo con la reivindicación 6, caracterizado porque el aumento en el número de copias de dicho ORF yaaU en al menos 1 se consigue por medio de un vector que se replica extracromosómicamente.

9. El microorganismo de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque:

a) la región promotora y reguladora o el sitio de fijación de ribosoma está mutada(o) aguas arriba de dicho ORF yaaU, o
b) están incorporados casetes de expresión o promotores aguas arriba del ORF yaaU.

10. El microorganismo de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque dicho polinucleótido yaaU se halla bajo el control de un promotor que intensifica la expresión del gen.

11. El microorganismo de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque la intensificación del ORF yaaU aumenta la concentración o actividad del producto (proteína) del gen yaaU al menos en un 10%, basada en la actividad o concentración del producto del gen en la cepa o microorganismo parental no recombinante para el ORF yaaU.

12. El microorganismo de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque otros genes del camino metabólico para la biosíntesis del L-aminoácido deseado están presentes también en forma sobreexpresada.

13. El microorganismo de acuerdo con la reivindicación 12, caracterizado porque el microorganismo se selecciona de los géneros Escherichia, Erwinia, Providencia y Serratia.

14. El microorganismo de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 13, caracterizado porque produce L-treonina.

15. Un proceso para preparar L-aminoácidos seleccionados del grupo L-treonina, L-valina y L-lisina por fermentación de microorganismos recombinantes de la familia Enterobacteriáceas, caracterizado porque

a) dichos microorganismos productores de L-aminoácidos de acuerdo con las reivindicaciones 1-14, se cultivan en un medio en condiciones en las cuales dicho L-aminoácido se enriquece en el medio o en las células, y
b) dicho L-aminoácido se aísla, quedando los constituyentes del caldo de fermentación, y/o la biomasa restante en su totalidad o en porciones (desde =q 0 a 100%) en el producto aislado o eliminándose por completo.

16. El proceso de acuerdo con la reivindicación 15, caracterizado porque, para el propósito de preparación de L-treonina, se fermentan microorganismos de la familia Enterobacteriáceas en los cuales uno o más de los genes seleccionados del grupo:

a) al menos un gen del operón thrABC que codifica aspartato-quinasa, homoserina-deshidrogenasa, homoserina-quinasa y treonina-sintasa,
b) el gen pyc de Corynebacterium glutamicum que codifica piruvato-carboxilasa,
c) el gen pps que codifica fosfoenolpiruvato-sintasa,
d) el ppc gen que codifica fosfoenolpiruvato carboxilasa,
e) los genes pntA y pntB que codifican las subunidades de piridina-transhidrogenasa,
f) el gen rhtB que codifica la proteína que confiere resistencia a homoserina,
g) el gen rhtC que codifica la proteína que confiere resistencia a treonina,
h) el gen thrE de Corynebacterium glutamicum que codifica la proteína del portador de exportación de treonina,
i) el gdhA gen que codifica glutamato-deshidrogenasa,
j) el gen pgm que codifica fosfoglucomutasa,
k) el gen fba que codifica fructosa-bifosfato-aldolasa,
l) el gen ptsH que codifica la proteína fosfohistidina-hexosa-fosfotransferasa,
m) el gen ptsI que codifica la enzima I del sistema de fosfotransferasa,
n) el gen crr que codifica el componente IIA específico de glucosa,
o) el gen ptsG que codifica el componente IIBC específico de glucosa,
p) el gen lrp que codifica el regulador del regulón leucina,
q) el gen fadR que codifica el regulador del regulón fad
r) el gen iclR que codifica el regulador del metabolismo central intermedio,
s) el gen ahpF del operón ahpCF que codifica la subunidad pequeña de alquil-hidroperóxido-reductasa,
t) el gen ahpF del operón ahpCF que codifica la subunidad grande de alquil-hidroperóxido-reductasa,
u) el gen cysK que codifica cisteína-sintasa A,
v) el gen cysB que codifica el regulador del regulón cys,
w) el gen cysJ que codifica la flavoproteína NADPH-sulfito-reductasa,
x) el gen cysI que codifica la hemoproteína NADPH-sulfito-reductasa,
y) el gen cysH que codifica adenilil-sulfato-reductasa,
z) el gen rseA que codifica una proteína de membrana que posee actividad anti-sigmaE,
a1) el gen rseC que codifica un regulador global del factor sigmaE,
b1) el gen sucA que codifica la subunidad descarboxilasa de 2-cetoglutarato-deshidrogenasa,
c1) el gen sucB que codifica la subunidad dihidrolipoil-transsuccinasa E2 de 2-cetoglutarato-deshidrogenasa,
d1) el gen sucC que codifica la subunidad ß de succinil-CoA-sintetasa,
e1) el gen sucD que codifica la subunidad a de succinil-CoA-sintetasa,
f1) el gen aceE que codifica el componente E1 del complejo piruvato-deshidrogenasa,
g1) el gen aceF que codifica el componente E2 del complejo piruvato-deshidrogenasa,
h1) el gen rseB que codifica el regulador de la actividad del factor sigmaE, y
i1) el producto génico del marco de lectura abierto (ORF) yodA de Escherichia coli,

está(n) adicionalmente sobreexpresados al mismo tiempo.

17. El proceso de acuerdo con las reivindicaciones 15 a 16, caracterizado porque se hace uso de microorganismos en los cuales los caminos metabólicos que reducen la formación de dicho L-aminoácido están al menos parcialmente atenuados.

18. El proceso de acuerdo con la reivindicación 17, caracterizado porque, para el propósito de preparación de L-treonina, se fermentan microorganismos de la familia Enterobacteriáceas en los cuales uno o más de los genes seleccionados del grupo:

a) el gen tdh que codifica treonina-deshidrogenasa,
b) el gen mdh que codifica malato-deshidrogenasa,
c) el producto génico del marco de lectura abierto (ORF) yjfA de Escherichia coli,
d) el producto génico del marco de lectura abierto (ORF) ytfP de Escherichia coli,
e) el gen pckA que codifica fosfoenolpiruvato-carboxiquinasa,
f) el gen poxB que codifica piruvato-oxidasa,
g) el gen dgsA que codifica el regulador DgsA del sistema de fosfotransferasa,
h) el gen fruR que codifica el represor fructosa,
i) el gen rpoS que codifica el factor sigma38, y
j) el gen aspA que codifica aspartato-amonio-liasa,

está/están atenuados adicionalmente al mismo tiempo, en particular eliminados, o su expresión está reducida.


 

Patentes similares o relacionadas:

Vacuna subunitaria contra Mycoplasma spp., del 1 de Julio de 2020, de Agricultural Technology Research Institute: Una composición para prevenir una infección por Mycoplasma spp., que comprende: un principio activo, que comprende una proteína de PdhA; y un adyuvante […]

Proteína mutante, del 19 de Febrero de 2020, de Cytiva BioProcess R&D AB: Una proteína de unión a inmunoglobulina que se une a regiones de una molécula de inmunoglobulina distintas de las regiones determinantes de […]

Nanoporos MSP y procedimientos relacionados, del 8 de Enero de 2020, de UNIVERSITY OF WASHINGTON: Porina de Mycobacterium Smegmatis (Msp) que tiene un vestíbulo y una zona de constricción que definen un túnel, en la que la Msp comprende una MspA mutante, […]

Complejos génicos sintéticos, del 28 de Agosto de 2019, de THE REGENTS OF THE UNIVERSITY OF CALIFORNIA: Un método para reemplazar la regulación nativa de un conjunto de genes asociados colectivamente con una función con regulación sintética, comprendiendo […]

Métodos de despliegue de proteínas que contienen dominios Fc no covalentes sobre la superficie de células y métodos de selección de las mismas, del 10 de Julio de 2019, de MERCK PATENT GMBH: Método para el despliegue de proteínas sobre la superficie de una célula huésped, comprendiendo el método: (a) introducir en una célula huésped al menos uno o más polinucleótidos […]

Polipéptidos efectores desinmunizados de subunidad A de toxina Shiga para aplicaciones en mamíferos, del 19 de Junio de 2019, de MOLECULAR TEMPLATES, INC: Polipéptido que comprende una región efectora de la toxina Shiga, en el que: (i) la región efectora de la toxina Shiga tiene al menos un 95% de identidad de secuencia […]

Proteína de exportación de O-fosfoserina novedosa y procedimiento para producir O-fosfoserina usando la misma, del 5 de Junio de 2019, de CJ CHEILJEDANG CORPORATION: Un procedimiento para producir O-fosfoserina (OPS), que comprende cultivar un microorganismo que produce Ofosfoserina que se ha modificado para potenciar […]

Bacterias lácticas texturizantes, del 16 de Abril de 2019, de Dupont Nutrition Biosciences ApS: Cepa bacteriana láctica que comprende al menos una secuencia seleccionada entre el grupo constituido por las secuencias de nucleótidos SEC ID Nº 1, SEC ID Nº […]

Utilizamos cookies para mejorar nuestros servicios y mostrarle publicidad relevante. Si continua navegando, consideramos que acepta su uso. Puede obtener más información aquí. .