PROCEDIMIENTOS PARA LA FABRICACION DE FIBRINOGENO.
Un método para la separación y purificación de fibrinógeno y plasminógeno,
que comprende las etapas de:
(a) cargar una solución que comprende fibrinógeno y plasminógeno en una matriz de cromatografía de afinidad por iones metálicos inmovilizados, bajo unas condiciones tales que el fibrinógeno y el plasminógeno se unen ambos a la matriz, y
(b) eluir selectivamente el fibrinógeno y el plasminógeno separadamente de la matriz
Tipo: Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: W03002928GB.
Solicitante: NHS BLOOD AND TRANSPLANT.
Nacionalidad solicitante: Reino Unido.
Dirección: OAK HOUSE REEDS CRESCENT,WATFORD WD24 4QN.
Inventor/es: FELDMAN,PETER BIO PRODUCTS LABORATORY, KINGSLAND,SARAH BIO PRODUCTS LABORATORY, CLEMMITT,ROBERT BIO PRODUCTS LABORATORY, EVANS,DAVID BIO PRODUCTS LABORATORY.
Fecha de Publicación: .
Clasificación Internacional de Patentes:
- C07K1/22 QUIMICA; METALURGIA. › C07 QUIMICA ORGANICA. › C07K PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas C07D; ipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina diones-2,5, C07D; alcaloides del cornezuelo del centeno de tipo péptido cíclico C07D 519/02; proteínas monocelulares, enzimas C12N; procedimientos de obtención de péptidos por ingeniería genética C12N 15/00). › C07K 1/00 Procedimientos generales de preparación de péptidos. › Cromatografía de afinidad o técnicas análogas basadas en procesos de absorción selectiva.
- C07K14/75 C07K […] › C07K 14/00 Péptidos con más de 20 aminoácidos; Gastrinas; Somatostatinas; Melanotropinas; Sus derivados. › Fibrinógeno.
Clasificación PCT:
- C07K1/22 C07K 1/00 […] › Cromatografía de afinidad o técnicas análogas basadas en procesos de absorción selectiva.
- C07K14/75 C07K 14/00 […] › Fibrinógeno.
- C12N9/10 C […] › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 9/00 Enzimas, p. ej. ligasas (6.); Proenzimas; Composiciones que las contienen (preparaciones para la limpieza de los dientes que contienen enzimas A61K 8/66, A61Q 11/00; preparaciones de uso médico que contienen enzimas A61K 38/43; composiciones detergentes que contienen enzimas C11D ); Procesos para preparar, activar, inhibir, separar o purificar enzimas. › Transferasas (2.) (ribonucleasas C12N 9/22).
- C12N9/68 C12N 9/00 […] › Plasmina, es decir, fibronolisina.
Clasificación antigua:
Fragmento de la descripción:
Procedimientos para la preparación de fibrinógeno.
La presente invención se refiere a procedimientos para la purificación del fibrinógeno, y a preparados de fibrinógeno fácilmente solubles.
El fibrinógeno es una proteína del plasma sanguíneo que está implicada en la formación de coágulos. Se convierte en el monómero fibrina por la acción de la proteasa del plasma trombina. Los monómeros de fibrina se agrupan para formar un coágulo débil y después se entrecruzan por la acción del factor XIII activado (es decir, el factor XIIIa) para formar un coágulo más fuerte. El fibrinógeno se usa en terapia en combinación con trombina en los llamados sellantes de fibrina, para conseguir la hemostasis, para cerrar las heridas y para la adhesión controlada del tejido. Los concentrados de fibrinógeno se usan también para el tratamiento de terapia de reemplazo de pacientes con déficit de fibrinógeno (afibrinogenemia), que puede ser heredado o adquirido.
Para todas las aplicaciones clínicas, es importante tener fibrinógeno muy puro con el fin de minimizar cualquier posible efecto secundario no deseable resultante, por ejemplo, de la presencia de proteínas contaminantes no deseadas. En particular, es deseable que los preparados de fibrinógeno para uso clínico estén exentos de plasminógeno y plasmina (Blomback B., Blomback M., "Purification of human and bovine fibrinogen", Arkiv for Kemi 1956; 10: 415-443, y Mosesson M. W., "The preparation of human fibrinogen free of plasminogen", Biochim Biophys Acta 1962, 57: 204-213). El plasminógeno es el precursor inactivo de la plasmina, una enzima fibrinolítica que digiere los coágulos de fibrina. Por consiguiente, la presencia de plasminógeno en un preparado de fibrinógeno destinado a ser usado in vivo es indeseable a causa de que cualquier posible plasmina generada a partir del plasminógeno en el sitio de la formación del coágulo puede entonces desestabilizar el coágulo.
El plasminógeno tiende a copurificarse con el fibrinógeno y su eliminación puede ser dificultosa. Algunos preparados clínicos de fibrinógeno contienen por tanto agentes antifibrinolíticos para inhibir cualquier posible plasmina o plasminógeno presentes (p. ej. aprotinina, una proteína bovina inhibidora de la plasmina; o ácido tranexámico, un inhibidor sintético de la plasmina asociado también con efectos secundarios neurotóxicos). Una ventaja de separar el plasminógeno del fibrinógeno es que entonces no hay necesidad de usar tales inhibidores fibrinolíticos en el preparado clínico de fibrinógeno.
Además, es muy deseable que el fibrinógeno derivado de fuentes humanas o animales sea tratado para inactivar cualquier virus de la sangre que puede estar presente, por ejemplo virus de la hepatitis o HIV. Se conocen en la técnica varios métodos de inactivación de virus, incluyendo pasteurización, tratamiento térmico en seco y tratamiento con disolvente-detergente (Pathogen Inactivation of Labile Blood Products, Council of Europe Expert Committee and Blood Transfusion Study Group on Pathogen Inactivation in Labile Blood Products, Transfusion Medicine, 2001, 11, 149-175).
Se sabe que el tratamiento térmico en seco es eficaz para la inactivación tanto de virus envueltos como de algunos no envueltos, mientras que el tratamiento con disolvente-detergente es conocido por ser eficaz para la inactivación de virus envueltos (es decir, recubiertos con lípidos) tales como el virus de la hepatitis B.
Se conocen en la técnica varios métodos para la purificación de fibrinógeno. Sin embargo, los métodos de purificación de la técnica anterior adolecen de varios inconvenientes. Por ejemplo, los métodos de precipitación no permiten la fácil incorporación de una etapa de inactivación de virus mediante disolvente-detergente (SD: Solvent-Detergent), ya que la eliminación de los reactivos de SD se lleva a cabo mucho más eficazmente mediante cromatografía. Los métodos de cromatografía pueden no separar el fibrinógeno del plasminógeno en una sola etapa, lo que puede conducir a la necesidad de una cromatografía adicional para adsorber el plasminógeno, o a la necesidad de añadir un agente antifibrinolíco al preparado final de fibrinógeno para combatir el plasminógeno residual. Además, no todos los métodos de la técnica anterior son adecuados para la purificación del fibrinógeno a partir de una amplia gama de soluciones que contienen fibrinógeno (incluyendo plasma y fracciones recombinantes).
La patente de EE.UU. nº 5.169.936 ha sugerido previamente que la cromatografía de afinidad por iones metálicos inmovilizados (IMAC: immobilised metal ion affinity chromatography) podría usarse en la preparación de fibrinógeno humano. Sin embargo, no se describen ejemplos de tal método, ni hay ninguna sugerencia de que podría usarse la IMAC para la separación de fibrinógeno del plasminógeno.
La gama de cromatografía ProSep® de Millipore ofrece absorbentes desarrollados para la purificación de moléculas biológicas usando IMAC. Se ha anunciado que Prosep Chelating III es adecuado para la separación de moléculas grandes tales como fibrinógeno.
Se sabe también que la disolución de concentrados de fibrinógeno puede ser difícil, y que con frecuencia requiere el uso de temperaturas elevadas o una agitación prolongada (veánse la patente de EE.UU. nº 5.260.420 y el documento EP-A 0804933). Debido a la inestabilidad de las soluciones líquidas de fibrinógeno a lo largo del tiempo, los preparados de fibrinógeno para uso clínico se comercializan en forma de solución congelada a baja temperatura o bien como liofilizado (es decir, un preparado secado congelado). Antes de su uso, el producto comercial ha de ser descongelado o bien reconstituido a partir del liofilizado. Las dos medidas requieren un tiempo y un esfuerzo significativos.
Por tanto, sería conveniente proporcionar métodos alternativos para la purificación del fibrinógeno, en particular un método que sea aplicable a cualquier material de partida que contenga fibrinógeno y que permita la incorporación de una o más etapas de inactivación de virus. También sería ventajoso proporcionar un método para la separación de fibrinógeno del plasminógeno. Además, sería ventajoso proporcionar un concentrado de fibrinógeno liofilizado, y preferentemente tratado térmicamente, que pueda ser fácilmente redisuelto a temperatura ambiente.
En un aspecto, la presente invención proporciona por tanto un método para la separación y purificación de fibrinógeno y plasminógeno, que comprende las etapas de:
(a) cargar una solución que comprende fibrinógeno y plasminógeno en una matriz de cromatografía de afinidad por iones metálicos inmovilizados, bajo unas condiciones tales que el fibrinógeno y el plasminógeno se unen ambos a la matriz, y
(b) eluir selectivamente el fibrinógeno y el plasminógeno separadamente de la matriz. El fibrinógeno y el plasminógeno pueden recogerse por separado y ser tratados cada uno de ellos según se requiera.
Preferentemente, la solución que comprende fibrinógeno es una fracción de plasma que contiene fibrinógeno.
En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para la separación de fibrinógeno de plasminógeno, que comprende el uso de cromatografía de afinidad por iones metálicos inmovilizados. Preferentemente, el método comprende las etapas de:
(a) cargar una solución que comprende fibrinógeno y plasminógeno en una matriz de cromatografía de afinidad por iones metálicos inmovilizados, bajo unas condiciones tales que al menos el fibrinógeno se une a la matriz, y
(b) eluir selectivamente el fibrinógeno de la matriz. Preferentemente, el plasminógeno se une también a la matriz y el plasminógeno y el fibrinógeno pueden ser eluidos de la matriz selectivamente por separado.
Como se usa en el presente texto, las referencias a la separación y/o a la purificación de fibrinógeno incluyen la separación conjunta y/o la copurificación de fibrinógeno y factor XIII juntos a partir de materiales de partida que comprenden tanto fibrinógeno como factor XIII.
El material de partida para los métodos de la presente invención puede ser cualquier solución que contenga fibrinógeno, incluyendo plasma humano o animal, o una fracción del plasma, fracciones de cultivo de células de la tecnología recombinante, fracciones derivadas de leche de animales transgénicos, etc. Los materiales de partida preferidos son fracciones de plasma tales como crioprecipitado, precipitado de heparina y precipitado...
Reivindicaciones:
1. Un método para la separación y purificación de fibrinógeno y plasminógeno, que comprende las etapas de:
(a) cargar una solución que comprende fibrinógeno y plasminógeno en una matriz de cromatografía de afinidad por iones metálicos inmovilizados, bajo unas condiciones tales que el fibrinógeno y el plasminógeno se unen ambos a la matriz, y
(b) eluir selectivamente el fibrinógeno y el plasminógeno separadamente de la matriz.
2. Un método para la separación de fibrinógeno de plasminógeno, que comprende las etapas de:
(a) cargar una solución que comprende fibrinógeno y plasminógeno en una matriz de cromatografía de afinidad por iones metálicos inmovilizados, bajo unas condiciones tales que al menos el fibrinógeno se une a la matriz, y
(b) eluir selectivamente el fibrinógeno de la matriz.
3. Un método según la reivindicación 2ª, en el que el plasminógeno y el fibrinógeno son eluidos de la matriz selectivamente por separado.
4. Un método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la solución que comprende fibrinógeno es una fracción de plasma que contiene fibrinógeno.
5. Un método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la solución que comprende fibrinógeno comprende además factor XIII, y el factor XIII es co-eluido de la matriz con el fibrinógeno.
6. Un método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende además la etapa de concentrar el fibrinógeno mediante ultrafiltración hasta una concentración de 15 a 30 mg/ml.
7. El método según la reivindicación 6ª, que comprende además las etapas de:
8. El método según la reivindicación 7ª, en el que los estabilizantes incluyen un aminoácido, un hidrato de carbono, una sal y un detergente.
9. El método según la reivindicación 7ª o la reivindicación 8ª, que comprende además la etapa de someter la formulación de fibrinógeno liofilizada a un tratamiento térmico en seco.
10. El uso de cromatografía de afinidad por iones metálicos inmovilizados, para la separación de fibrinógeno del plasminógeno.
11. El uso de cromatografía de afinidad por iones metálicos inmovilizados, para la separación y purificación de fibrinógeno y plasminógeno.
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