EXPRESION Y EXPORTACION DE ANGIOSTATINA Y DE ENDOSTATINA COMO INMUNOFUSINAS.

Una proteína de fusión homodimérica, que tiene actividad inhibidora de la angiogénesis,

que comprende una región Fc de inmunoglobulina y una proteína diana, comprendiendo la región Fc una región bisagra, un dominio CH2 y un dominio CH3, y la proteína diana tiene la actividad inhibidora de la angiogénesis de la endostatina y es un fragmento de colágeno XVIII, y está ligada en el extremo N-terminal o en el extremo C-terminal de dicha región Fc de inmunoglobulina

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/US99/19329.

Solicitante: LEXINGEN PHARMACEUTICALS CORPORATION.

Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.

Dirección: 125 HARTWELL AVENUE,LEXINGTON, MA 02173.

Inventor/es: GILLIES, STEPHEN, D., LO, KIN, MING, LI,YUE.

Fecha de Publicación: .

Fecha Concesión Europea: 31 de Marzo de 2010.

Clasificación Internacional de Patentes:

  • C07K14/515 SECCION C — QUIMICA; METALURGIA.C07 QUIMICA ORGANICA.C07K PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas C07D; ipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina diones-2,5, C07D; alcaloides del cornezuelo del centeno de tipo péptido cíclico C07D 519/02;   proteínas monocelulares, enzimas C12N; procedimientos de obtención de péptidos por ingeniería genética C12N 15/00). › C07K 14/00 Péptidos con más de 20 aminoácidos; Gastrinas; Somatostatinas; Melanotropinas; Sus derivados. › Factor angiogénico; Angiogenina.
  • C07K14/78 C07K 14/00 […] › Péptidos del tejido conectivo, p. ej. colágeno, elastina, laminina, fibronectina, vitronectina, globulina insoluble en frío (CIG).
  • C12N15/62 C […] › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN (biocidas, productos que repelen o atraen a los animales nocivos, o reguladores del crecimiento de los vegetales, que contienen microorganismos virus, hongos microscópicos, enzimas, productos de fermentación o sustancias obtenidas por o extraídas de microorganismos o sustancias animales A01N 63/00; preparaciones de uso médico A61K; fertilizantes C05F ); PROPAGACION,CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Secuencias de ADN que codifican proteínas de fusión.
  • C12N9/68 C12N […] › C12N 9/00 Enzimas, p. ej. ligasas (6.; Proenzimas; Composiciones que las contienen (preparaciones para la limpieza de los dientes que contienen enzimas A61K 8/66, A61Q 11/00; preparaciones de uso médico que contienen enzimas A61K 38/43; composiciones detergentes que contienen enzimas C11D ); Procesos para preparar, activar, inhibir, separar o purificar enzimas. › Plasmina, es decir, fibronolisina.

Clasificación PCT:

  • C07K14/515 C07K 14/00 […] › Factor angiogénico; Angiogenina.
  • C07K14/78 C07K 14/00 […] › Péptidos del tejido conectivo, p. ej. colágeno, elastina, laminina, fibronectina, vitronectina, globulina insoluble en frío (CIG).
  • C07K19/00 C07K […] › Péptidos híbridos (Inmoglobulinas híbridas compuestas   solamente de inmoglobulinas C07K 16/46).
  • C12N15/62 C12N 15/00 […] › Secuencias de ADN que codifican proteínas de fusión.
  • C12N9/68 C12N 9/00 […] › Plasmina, es decir, fibronolisina.

Clasificación antigua:

  • C07K14/515 C07K 14/00 […] › Factor angiogénico; Angiogenina.
  • C07K14/78 C07K 14/00 […] › Péptidos del tejido conectivo, p. ej. colágeno, elastina, laminina, fibronectina, vitronectina, globulina insoluble en frío (CIG).
  • C07K19/00 C07K […] › Péptidos híbridos (Inmoglobulinas híbridas compuestas   solamente de inmoglobulinas C07K 16/46).
  • C12N15/62 C12N 15/00 […] › Secuencias de ADN que codifican proteínas de fusión.
  • C12N9/68 C12N 9/00 […] › Plasmina, es decir, fibronolisina.

Fragmento de la descripción:

Expresión y exportación de angiostatina y de endostatina como inmunofusinas.

Campo de la invención

Esta invención se refiere, de manera general, a métodos y a composiciones para la producción y para la utilización de proteínas de fusión que contienen un inhibidor de la angiogénesis. De una manera más particular, la invención se refiere a métodos y a composiciones para la producción y para la utilización de proteínas de fusión denominadas inmunofusinas, que contienen una región Fc de inmunoglobulina y una proteína diana, que tiene la actividad inhibidora de la angiogénesis de la endostatina y es un fragmento de colágeno XVIII.

Fundamento de la invención

Se han descubierto dos potentes inhibidores de la angiogénesis, la angiostatina (O'Reilly et al. (1994) Cell 79: 315) y la endostatina (O'Reilly et al. (1997) Cell 88: 277), y se ha encontrado que son generados de manera natural por los tumores primarios. Ambas proteínas son inhibidores específicos de la proliferación de las células endoteliales y que inhiben el crecimiento de los tumores mediante el bloque de la angiogénesis, que consiste en la formación de nuevos vasos sanguíneos, que alimentan a los tumores. Se ha puesto de manifiesto por medio de estudios que estos inhibidores de la angiogénesis no son tóxicos incluso a dosis muy altas y que éstos pueden suprimir el crecimiento de las metástasis y que los tumores primarios pueden regresar hasta un estado microscópico durmiente. Ambos inhibidores han sido identificados como fragmentos proteolíticos de un gran número de moléculas intactas. Se ha encontrado que la angiostatina es un fragmento de plasminógeno, y que la endostatina es un fragmento del colágeno XVIII.

Estas dos proteínas han provocado un gran interés en el área del cáncer, dado que se ha mostrado que suprimen el crecimiento de un gran número de diversos tipos de tumores en ratones, con efectos laterales o resistencia al fármaco, no obvios. La quimioterapia tradicional conduce, por regla general, a una resistencia adquirida al fármaco, que está provocada originalmente por la inestabilidad genética de las células cancerosas. Las terapias que utilizan inhibidores de la angiogénesis, en lugar de ir dirigidas a las células cancerosas, van dirigidas a las células normales endoteliales, que favorecen el crecimiento del tumor. Puesto que las células endoteliales son genéticamente estables, es posible que las terapias con inhibidores de la angiogénesis puedan dar como resultado una menor resistencia al fármaco. Los estudios realizados indican que la resistencia al fármaco no se desarrolla en ratones expuestos a una dormancia tumoral prolongada y que no se produce una recurrencia de los tumores como consecuencia de una intermisión de la terapia (Boehrn et al. (1997) Nature 390:404).

Independientemente de los resultados prometedores en ratones, no ha sido posible producir angiostatina ni endostatina activa, soluble en grado clínico, en cantidades comerciales empleándose sistemas de expresión en E. coli, en baculovirus, en levaduras y en mamíferos. La expresión en E. coli dio como resultado agregados proteicos insolubles de composición indefinida, que no pudieron ser inyectados en seres humanos. Otros métodos de producción, tales como los sistemas de expresión en baculovirus y en mamíferos, dieron como resultado niveles muy bajos de las proteínas recombinantes (O'Reilly et al. (1997) Cell 88:277).

Los bajos rendimientos de los sistemas de expresión, hasta la fecha, pueden ser explicados debido a que tanto la angiostatina como la endostatina son fragmentos internos de un gran número de proteínas. Es posible que las proteínas truncadas no sea plieguen adecuadamente en ausencia de los residuos que son escindidos a partir de las moléculas precursoras. Por ejemplo, la angiostatina tiene 26 residuos de cisteína, que forman numerosos enlaces de disulfuro. Es posible que la expresión de la angiostatina no proporcione por si misma el medio óptimo para que se formen correctamente en la vía secretoria estos numerosos enlaces de disulfuro. De igual modo, la proteína de endostatina recombinante, producida en E. coli, se precipita durante la diálisis, posiblemente debido al carácter hidrófugo de la endostatina (O'Reilly et al. (1997) Cell 88:277).

La barrera principal para la utilización de la angiostatina y de la endostatina en sus formas actuales consiste en las cantidades relativamente grandes de proteínas que deben ser inyectadas diariamente durante semanas o meses para alcanzar el resultado clínico deseado. Por ejemplo, en los modelos actuales con ratones se necesitan dosis de 20 mg/kg/día de endostatina para demostrar una eficacia óptima (Boehm et al. (1997) Nature 390:404). Dado que existe una urgente necesidad de ensayar la endostatina y la angiostatina por vía clínica, es importante un método de producción, que pueda generar grandes cantidades de material de grado clínico.

Un sistema de expresión, que ha sido utilizado para producir la expresión a nivel elevado de proteínas de fusión en células de mamíferos, es un constructo de ADN, que codifica una secuencia señal, una región Fc de inmunoglobulina y una proteína diana. El producto de la fusión de este constructo se denomina, por regla general, como una "inmunofusina". Se han expresado con éxito diversas proteínas diana como inmunofusinas que incluyen: IL2, CD26, Tat, Rev, OSF-2, ßIG-H3, receptor de IgE, PSMA, y gp120. Estos constructos de expresión están descritos en la patente norteamericana número 5,541,087 y en la patente norteamericana número 5,726,044.

Un propuesta principal de expresión de proteínas de fusión recombinantes en células de mamíferos ha consistido en intentar conferir propiedades nuevas o convenientes a las moléculas híbridas, por ejemplo un plegamiento adecuado, un aumento de la solubilidad, una idoneidad para una citocina o para una toxina in vivo, un enlace del receptor Fc, una fijación complemento, un enlace de la proteína A, un aumento de circulación de semivida y una habilidad acrecentada para cruzar la barrera sangre-cerebro. Ejemplos de proteínas de fusión recombinantes producidas en células de mamíferos incluyen los inmunoconjugados de citocina (Gillies et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 1428; Gillies et al. (1993) Bioconjugate Chemistry 4: 230), inmunoadhesinas (Capon et al. (1989) Nature 337: 525), inmunotoxinas (Chaudhary et al. (1989) Nature 339: 394), y un conjugado del factor del crecimiento de los nervios (Friden et al. (1993) Science 259: 373).

Un objeto de la invención consiste en proporcionar nuevos ADN, que codifican proteínas de fusión con actividad inhibidora de la angiogénesis y que facilitan la producción y la secreción eficientes de inhibidores de la angiogénesis en una variedad de células huésped de mamíferos.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a métodos y a composiciones convenientes para la producción y para el empleo de proteínas de fusión, que comprenden una región Fc de inmunoglobulina y a una proteína diana, que tiene la actividad inhibidora de la angiogénesis de la endostatina y es un fragmento de colágeno XVIII. Las proteínas de fusión pueden facilitar un elevado nivel de expresión de proteínas inhibidoras de la angiogénesis biológicamente activas. Las proteínas inhibidoras de la angiogénesis pueden ser escindidas a continuación a partir de la proteína de fusión y pueden ser combinadas con un excipiente farmacéuticamente aceptable como paso previo a su administración a un mamífero, por ejemplo a un ser humano.

La invención proporciona, en un aspecto, moléculas de ácido nucleico, por ejemplo, moléculas de ADN o moléculas de ARN, que codifican una proteína de fusión de la invención. La molécula de ácido nucleico codifica una secuencia señal, una región Fc de inmunoglobulina y, al menos, una proteína diana, denominada aquí también como la proteína inhibidora de la angiogénesis, siendo dicha proteína diana, al menos única, la endostatina, o un fragmento de colágeno XVIII, que tiene actividad de endostatina. En una realización preferente, la molécula de ácido nucleico codifica, en serie, en el sentido 5' hacia 3', la secuencia señal, la región Fc de inmunoglobulina y la secuencia de la proteína diana. En otra realización preferente, la molécula de ácido nucleico codifica, en serie en el sentido 5' hacia 3', la secuencia señal, la secuencia diana y la región Fc de inmunoglobulina.

En otra realización preferente, la región Fc de inmunoglobulina comprende...

 


Reivindicaciones:

1. Una proteína de fusión homodimérica, que tiene actividad inhibidora de la angiogénesis, que comprende una región Fc de inmunoglobulina y una proteína diana, comprendiendo la región Fc una región bisagra, un dominio CH2 y un dominio CH3, y la proteína diana tiene la actividad inhibidora de la angiogénesis de la endostatina y es un fragmento de colágeno XVIII, y está ligada en el extremo N-terminal o en el extremo C-terminal de dicha región Fc de inmunoglobulina.

2. Una proteína de fusión homodimérica de la reivindicación 1, en la que la proteína diana es la endostatina o un fragmento bioactivo de la misma.

3. Una proteína de fusión homodimérica según la reivindicación 2, en la que la proteína diana comprende la secuencia de aminoácidos indicada en la SEQ ID No. 4.

4. Una proteína de fusión homodimérica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que la proteína diana está conectada con el extremo C-terminal de la región Fc.

5. Una proteína de fusión homodimérica según la reivindicación 1, 2 o 3, que comprende, además, una segunda proteína diana, que es un fragmento plasminógeno o un fragmento de colágeno XVIII y tiene la actividad inhibidora de la angiogénesis de la angiostatina o de la endostatina.

6. Una proteína de fusión homodimérica de la reivindicación 5, en la que dicha segunda proteína diana es la endostatina o la angiostatina o un fragmento bioactivo de las mismas.

7. Una proteína de fusión homodimérica según la reivindicación 5 o 6, en la que dicha segunda proteína diana está ligada, a través de un segmento enlazador polipeptídico, con dicha primera proteína diana.

8. Una proteína de fusión homodimérica según la reivindicación 7, en la que dicha primera proteína diana está conectada con el extremo N-terminal de la región Fc y dicha segunda proteína diana está ligada con el extremo C-terminal de la región Fc.

9. Una proteína de fusión homodimérica según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8, en la que dicha primera proteína diana es la endostatina y dicha segunda proteína diana es la angiostatina o un fragmento bioactivo de la misma.

10. Una proteína de fusión homodimérica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en la que la inmunoglobulina es la IgG1.

11. Una molécula de ADN, que codifica una secuencia señal y una proteína de fusión tal como se ha indicado en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.

12. Un vector de expresión replicable para la transfección de una célula de mamífero, que comprende un ADN de la reivindicación 11.

13. Un método para la producción de una proteína de fusión homodimérica, tal como se ha indicado en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, que comprende las etapas de:

(a) la transfección de una célula de mamífero con el vector de la reivindicación 12,
(b) el cultivo de la célula de mamífero para producir dicha proteína de fusión, y
(c) el aislamiento de dicha proteína de fusión.

 

Patentes similares o relacionadas:

Composición farmacéutica que contiene, como ingrediente activo, la proteína mutante del factor estimulante de colonias de granulocitos o la proteína de fusión de transferrina de la misma, del 8 de Mayo de 2019, de SUPEX BNP CO., LTD: Una proteína de fusión en la que la transferrina está unida por un péptido a un terminal de una proteína mutante del factor estimulante de colonias de granulocitos […]

Selección de células que expresan polipéptidos heterómeros, del 30 de Abril de 2019, de IMMUNEX CORPORATION: Un método para producir y aislar un complejo de cadena pesada y ligera de inmunoglobulina heterómera que comprende transfectar células con un vector […]

Proteínas de fusión y métodos para tratar, prevenir o mejorar el dolor, del 24 de Abril de 2019, de Ipsen Bioinnovation Limited: Una proteína de fusión polipeptídica de cadena sencilla, que comprende: a. una proteasa no citotóxica, proteasa que escinde una proteína del […]

Proteínas de fusión y usos de las mismas, del 17 de Abril de 2019, de MORPHOSYS AG: Una proteína de fusión que comprende una proteína de membrana fusionada en el terminal N a una proteína principal de la cápsida de un retrovirus, […]

Expresión de una proteína quimérica KSAC y procedimiento de producción de proteínas solubles a alta presión, del 17 de Abril de 2019, de Boehringer Ingelheim Animal Health USA Inc: Procedimiento para producir una proteína soluble expresada en procariotas o eucariotas que comprende las etapas de: (i) preparar cuerpos de inclusión […]

Enzimas y métodos para la síntesis del estireno, del 15 de Abril de 2019, de Phytogene, Inc: Una célula hospedadora que comprende: (a) una proteína de fusión expresada recombinantemente que comprende un primer dominio que comprende una fenilalanina amonio liasa, […]

Proteínas que tienen actividad nucleasa, proteínas de fusión y usos de estas, del 15 de Abril de 2019, de HELMHOLTZ ZENTRUM MUNCHEN DEUTSCHES FORSCHUNGSZENTRUM FUR GESUNDHEIT UND UMWELT (GMBH): Una molécula de ácido nucleico que codifica (I) un polipéptido que tiene la actividad de una endonucleasa, que es (a) una molécula de ácido nucleico que codifica […]

Vectores de transferencia de gen lentivírico y sus aplicaciones medicinales, del 11 de Abril de 2019, de INSTITUT PASTEUR: Una combinación de compuestos para su uso en el tratamiento terapéutico o profiláctico de una infección por un Virus de la Inmunodeficiencia en donde los […]

Otras patentes de la CIP C12N9/68