Una proteína de fusión homodimérica, que tiene actividad inhibidora de la angiogénesis,

que comprende una región Fc de inmunoglobulina y una proteína diana, comprendiendo la región Fc una región bisagra, un dominio CH2 y un dominio CH3, y la proteína diana tiene la actividad inhibidora de la angiogénesis de la endostatina y es un fragmento de colágeno XVIII, y está ligada en el extremo N-terminal o en el extremo C-terminal de dicha región Fc de inmunoglobulina

Expresión y exportación de angiostatina y de endostatina como inmunofusinas.

Campo de la invención

Esta invención se refiere, de manera general, a métodos y a composiciones para la producción y para la utilización de proteínas de fusión que contienen un inhibidor de la angiogénesis. De una manera más particular, la invención se refiere a métodos y a composiciones para la producción y para la utilización de proteínas de fusión denominadas inmunofusinas, que contienen una región Fc de inmunoglobulina y una proteína diana, que tiene la actividad inhibidora de la angiogénesis de la endostatina y es un fragmento de colágeno XVIII.

Fundamento de la invención

Se han descubierto dos potentes inhibidores de la angiogénesis, la angiostatina (O'Reilly et al. (1994) Cell 79: 315) y la endostatina (O'Reilly et al. (1997) Cell 88: 277), y se ha encontrado que son generados de manera natural por los tumores primarios. Ambas proteínas son inhibidores específicos de la proliferación de las células endoteliales y que inhiben el crecimiento de los tumores mediante el bloque de la angiogénesis, que consiste en la formación de nuevos vasos sanguíneos, que alimentan a los tumores. Se ha puesto de manifiesto por medio de estudios que estos inhibidores de la angiogénesis no son tóxicos incluso a dosis muy altas y que éstos pueden suprimir el crecimiento de las metástasis y que los tumores primarios pueden regresar hasta un estado microscópico durmiente. Ambos inhibidores han sido identificados como fragmentos proteolíticos de un gran número de moléculas intactas. Se ha encontrado que la angiostatina es un fragmento de plasminógeno, y que la endostatina es un fragmento del colágeno XVIII.

Estas dos proteínas han provocado un gran interés en el área del cáncer, dado que se ha mostrado que suprimen el crecimiento de un gran número de diversos tipos de tumores en ratones, con efectos laterales o resistencia al fármaco, no obvios. La quimioterapia tradicional conduce, por regla general, a una resistencia adquirida al fármaco, que está provocada originalmente por la inestabilidad genética de las células cancerosas. Las terapias que utilizan inhibidores de la angiogénesis, en lugar de ir dirigidas a las células cancerosas, van dirigidas a las células normales endoteliales, que favorecen el crecimiento del tumor. Puesto que las células endoteliales son genéticamente estables, es posible que las terapias con inhibidores de la angiogénesis puedan dar como resultado una menor resistencia al fármaco. Los estudios realizados indican que la resistencia al fármaco no se desarrolla en ratones expuestos a una dormancia tumoral prolongada y que no se produce una recurrencia de los tumores como consecuencia de una intermisión de la terapia (Boehrn et al. (1997) Nature 390:404).

Independientemente de los resultados prometedores en ratones, no ha sido posible producir angiostatina ni endostatina activa, soluble en grado clínico, en cantidades comerciales empleándose sistemas de expresión en E. coli, en baculovirus, en levaduras y en mamíferos. La expresión en E. coli dio como resultado agregados proteicos insolubles de composición indefinida, que no pudieron ser inyectados en seres humanos. Otros métodos de producción, tales como los sistemas de expresión en baculovirus y en mamíferos, dieron como resultado niveles muy bajos de las proteínas recombinantes (O'Reilly et al. (1997) Cell 88:277).

Los bajos rendimientos de los sistemas de expresión, hasta la fecha, pueden ser explicados debido a que tanto la angiostatina como la endostatina son fragmentos internos de un gran número de proteínas. Es posible que las proteínas truncadas no sea plieguen adecuadamente en ausencia de los residuos que son escindidos a partir de las moléculas precursoras. Por ejemplo, la angiostatina tiene 26 residuos de cisteína, que forman numerosos enlaces de disulfuro. Es posible que la expresión de la angiostatina no proporcione por si misma el medio óptimo para que se formen correctamente en la vía secretoria estos numerosos enlaces de disulfuro. De igual modo, la proteína de endostatina recombinante, producida en E. coli, se precipita durante la diálisis, posiblemente debido al carácter hidrófugo de la endostatina (O'Reilly et al. (1997) Cell 88:277).

La barrera principal para la utilización de la angiostatina y de la endostatina en sus formas actuales consiste en las cantidades relativamente grandes de proteínas que deben ser inyectadas diariamente durante semanas o meses para alcanzar el resultado clínico deseado. Por ejemplo, en los modelos actuales con ratones se necesitan dosis de 20 mg/kg/día de endostatina para demostrar una eficacia óptima (Boehm et al. (1997) Nature 390:404). Dado que existe una urgente necesidad de ensayar la endostatina y la angiostatina por vía clínica, es importante un método de producción, que pueda generar grandes cantidades de material de grado clínico.

Un sistema de expresión, que ha sido utilizado para producir la expresión a nivel elevado de proteínas de fusión en células de mamíferos, es un constructo de ADN, que codifica una secuencia señal, una región Fc de inmunoglobulina y una proteína diana. El producto de la fusión de este constructo se denomina, por regla general, como una "inmunofusina". Se han expresado con éxito diversas proteínas diana como inmunofusinas que incluyen: IL2, CD26, Tat, Rev, OSF-2, ßIG-H3, receptor de IgE, PSMA, y gp120. Estos constructos de expresión están descritos en la patente norteamericana número 5,541,087 y en la patente norteamericana número 5,726,044.

Un propuesta principal de expresión de proteínas de fusión recombinantes en células de mamíferos ha consistido en intentar conferir propiedades nuevas o convenientes a las moléculas híbridas, por ejemplo un plegamiento adecuado, un aumento de la solubilidad, una idoneidad para una citocina o para una toxina in vivo, un enlace del receptor Fc, una fijación complemento, un enlace de la proteína A, un aumento de circulación de semivida y una habilidad acrecentada para cruzar la barrera sangre-cerebro. Ejemplos de proteínas de fusión recombinantes producidas en células de mamíferos incluyen los inmunoconjugados de citocina (Gillies et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 1428; Gillies et al. (1993) Bioconjugate Chemistry 4: 230), inmunoadhesinas (Capon et al. (1989) Nature 337: 525), inmunotoxinas (Chaudhary et al. (1989) Nature 339: 394), y un conjugado del factor del crecimiento de los nervios (Friden et al. (1993) Science 259: 373).

Un objeto de la invención consiste en proporcionar nuevos ADN, que codifican proteínas de fusión con actividad inhibidora de la angiogénesis y que facilitan la producción y la secreción eficientes de inhibidores de la angiogénesis en una variedad de células huésped de mamíferos.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a métodos y a composiciones convenientes para la producción y para el empleo de proteínas de fusión, que comprenden una región Fc de inmunoglobulina y a una proteína diana, que tiene la actividad inhibidora de la angiogénesis de la endostatina y es un fragmento de colágeno XVIII. Las proteínas de fusión pueden facilitar un elevado nivel de expresión de proteínas inhibidoras de la angiogénesis biológicamente activas. Las proteínas inhibidoras de la angiogénesis pueden ser escindidas a continuación a partir de la proteína de fusión y pueden ser combinadas con un excipiente farmacéuticamente aceptable como paso previo a su administración a un mamífero, por ejemplo a un ser humano.

La invención proporciona, en un aspecto, moléculas de ácido nucleico, por ejemplo, moléculas de ADN o moléculas de ARN, que codifican una proteína de fusión de la invención. La molécula de ácido nucleico codifica una secuencia señal, una región Fc de inmunoglobulina y, al menos, una proteína diana, denominada aquí también como la proteína inhibidora de la angiogénesis, siendo dicha proteína diana, al menos única, la endostatina, o un fragmento de colágeno XVIII, que tiene actividad de endostatina. En una realización preferente, la molécula de ácido nucleico codifica, en serie, en el sentido 5' hacia 3', la secuencia señal, la región Fc de inmunoglobulina y la secuencia de la proteína diana. En otra realización preferente, la molécula de ácido nucleico codifica, en serie en el sentido 5' hacia 3', la secuencia señal, la secuencia diana y la región Fc de inmunoglobulina.

En otra realización preferente, la región Fc...

1. Una proteína de fusión homodimérica, que tiene actividad inhibidora de la angiogénesis, que comprende una región Fc de inmunoglobulina y una proteína diana, comprendiendo la región Fc una región bisagra, un dominio CH₂ y un dominio CH₃, y la proteína diana tiene la actividad inhibidora de la angiogénesis de la endostatina y es un fragmento de colágeno XVIII, y está ligada en el extremo N-terminal o en el extremo C-terminal de dicha región Fc de inmunoglobulina.

2. Una proteína de fusión homodimérica de la reivindicación 1, en la que la proteína diana es la endostatina o un fragmento bioactivo de la misma.

3. Una proteína de fusión homodimérica según la reivindicación 2, en la que la proteína diana comprende la secuencia de aminoácidos indicada en la SEQ ID No. 4.

4. Una proteína de fusión homodimérica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que la proteína diana está conectada con el extremo C-terminal de la región Fc.

5. Una proteína de fusión homodimérica según la reivindicación 1, 2 o 3, que comprende, además, una segunda proteína diana, que es un fragmento plasminógeno o un fragmento de colágeno XVIII y tiene la actividad inhibidora de la angiogénesis de la angiostatina o de la endostatina.

6. Una proteína de fusión homodimérica de la reivindicación 5, en la que dicha segunda proteína diana es la endostatina o la angiostatina o un fragmento bioactivo de las mismas.

7. Una proteína de fusión homodimérica según la reivindicación 5 o 6, en la que dicha segunda proteína diana está ligada, a través de un segmento enlazador polipeptídico, con dicha primera proteína diana.

8. Una proteína de fusión homodimérica según la reivindicación 7, en la que dicha primera proteína diana está conectada con el extremo N-terminal de la región Fc y dicha segunda proteína diana está ligada con el extremo C-terminal de la región Fc.

9. Una proteína de fusión homodimérica según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8, en la que dicha primera proteína diana es la endostatina y dicha segunda proteína diana es la angiostatina o un fragmento bioactivo de la misma.

10. Una proteína de fusión homodimérica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en la que la inmunoglobulina es la IgG1.

11. Una molécula de ADN, que codifica una secuencia señal y una proteína de fusión tal como se ha indicado en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.

12. Un vector de expresión replicable para la transfección de una célula de mamífero, que comprende un ADN de la reivindicación 11.

13. Un método para la producción de una proteína de fusión homodimérica, tal como se ha indicado en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, que comprende las etapas de: