PROCEDIMIENTOS DE CONTROL DE CALIDAD PARA EMULSIONES DE ACEITE EN AGUA QUE CONTIENEN ESCUALENO.

Un procedimiento para fabricar un adyuvante en emulsión de aceite en agua,

que comprende las etapas de: (i) preparar una emulsión submicrónica de aceite en agua usando cantidades conocidas de un vehículo acuoso, un tensioactivo y escualeno; (ii) someter la emulsión a esterilización en filtro para proporcionar una emulsión esterilizada; (iii) medir el contenido en escualeno de la emulsión esterilizada; y (iv) comparar el contenido en escualeno medido en la etapa (iii) con el contenido en escualeno conocido de la etapa (i), en el que, si la comparación de la etapa (iv) revela que el contenido en escualeno ha cambiado significativamente entre las etapas (i) y (iii), se rechaza el adyuvante

Procedimientos de control de calidad para emulsiones de aceite en agua que contienen escualeno.

Campo técnico

La presente invención pertenece al campo de la fabricación de adyuvantes para vacunas y, en particular, de los ensayos de control de calidad para adyuvantes en emulsión de aceite en agua que contienen escualeno.

Técnica anterior

El adyuvante para vacunas conocido como "MF59" [1-3] es una emulsión en submicrones de aceite en agua de escualeno, Tween 80 y Span 85. Puede también incluir iones citrato, por ejemplo tampón de citrato sódico 10 mM. La composición de la emulsión por volumen puede ser de aproximadamente 5% de escualeno, aproximadamente 0,5% de polisorbato 80 y aproximadamente 0,5% de Span 85. El adyuvante se describe con más detalle en el capítulo 10 de la ref. 4 y el capítulo 12 de la ref. 5. Las gotas de aceite en MF59 son lo suficientemente pequeñas como para filtrarse en esterilización a través de un filtro de 0,2 µm.

Dado que es un adyuvante para administrar a seres humanos (por ejemplo, está incluido en la vacuna FLUID^TM), el control de calidad de la vacuna es particularmente importante y la variación entre lotes se ha de controlar dentro de estrechos límites. Los parámetros que son importantes para MF59 incluyen el tamaño medio de la gota en la emulsión, la biocarga, el pH, el aspecto visual y la presencia de productos de degradación o de contaminantes habituales de sus ingredientes.

Es un objeto de la invención proporcionar otros ensayos y mejorados para el control de la calidad de los adyuvantes en emulsión de aceite en agua tales como MF59.

Divulgación de la invención

Ahora se ha descubierto que las determinaciones del contenido de escualeno en lotes del adyuvante MF59 pueden usarse como modo de comprobar los problemas durante la producción. En particular, se ha descubierto que una gota en el contenido en escualeno puede indicar que se han producido problemas en la filtración. El análisis del contenido en escualeno en los últimos lotes es más fácil que investigar las características del filtro, en particular si el filtro es parte de un aparato que está siendo mantenido en condiciones de GMP; y, de este modo, el ensayo de escualeno simplifica el control de calidad de las emulsiones de aceite en agua.

Por tanto, la invención proporciona un procedimiento de ensayo de control de calidad para un adyuvante en emulsión de aceite en agua, en el que el adyuvante comprende escualeno y en el que el procedimiento comprende una etapa de comparar el contenido real en escualeno del adyuvante con un contenido estándar en escualeno. Si el contenido real de escualeno difiere del contenido estándar, se ha producido un fallo de producción y, de este modo, el adyuvante no pasa la prueba del control de calidad; no obstante, si el contenido real es aceptable, el adyuvante pasa la prueba de control de calidad y puede usarse para la fabricación de vacunas.

La invención también proporciona un procedimiento para fabricar un adyuvante de emulsión de aceite en agua, que comprende las etapas de: (i) preparar una emulsión submicrónica de aceite en agua usando cantidades conocidas de un vehículo acuoso, un tensioactivo y escualeno; (ii) someter la emulsión a esterilización en filtro para proporcionar una emulsión esterilizada; y (iii) medir el contenido en escualeno de la emulsión esterilizada. El contenido en escualeno medido en la etapa (iii) puede compararse con el contenido en escualeno conocido de la etapa (i). Si esta comparación revela que el contenido en escualeno ha cambiado significativamente, se ha producido un fallo de producción y, por tanto, el adyuvante no pasa la prueba de control de calidad.

Antes de administrarse a un paciente, normalmente un adyuvante en emulsión se mezcla con un antígeno. La mezcla puede tener lugar de forma extemporánea, en el momento de usar (en cuyo caso el antígeno y el adyuvante se empaquetan por separad) o puede tener lugar durante la fabricación de la vacuna, antes de la carga. En la primera situación, la prueba de control de calidad se realizará con el propio adyuvante, En la última situación, la prueba de control de calidad puede tener lugar con el adyuvante antes de mezclarlo con el antígeno y/o con la mezcla adyuvante-antígeno.

Por tanto, la invención también proporciona un procedimiento de prueba de control de calidad para una vacuna que incluye un adyuvante en emulsión de aceite en agua que incluye escualeno, en el que el procedimiento comprende las etapas de: (i) comparar el contenido real de escualeno del adyuvante con un contenido estándar de escualeno; y, si el contenido real de escualeno es aceptable, (ii) preparar la vacuna combinando el adyuvante con un antígeno. La etapa (ii) puede implicar empaquetar el adyuvante y el antígeno por separado, de modo que se pueden mezclar en el momento del uso, o puede implicar mezclarlos antes o durante la carga.

De igual forma, la invención proporciona un procedimiento de prueba de control de calidad para una vacuna que incluye un antígeno y un adyuvante en emulsión de aceite en agua que incluye escualeno, en el que el procedimiento comprende una etapa de comparar el contenido real en escualeno de la vacuna con un contenido estándar en escualeno. Si el contenido real de escualeno difiere del contenido estándar, se ha producido un fallo de producción y, de este modo, la vacuna no pasa la prueba del control de calidad; no obstante, si el contenido real es aceptable, la vacuna pasa la prueba de control de calidad y puede sacarse a la venta y/o distribución.

La invención es particularmente útil durante la fabricación de vacunas con el virus de la gripe y, por tanto, la invención proporciona un procedimiento que comprende una etapa de mezclar (i) un antígeno del virus de la gripe y (ii) un adyuvante en emulsión de aceite en agua que incluye escualeno, y en el que el procedimiento también incluye una etapa en la que se mide el contenido en escualeno (a) en el adyuvante antes de la etapa de mezclado y/o (b) en la mezcla antígeno-adyuvante tras la etapa de mezclado. Como se ha mencionado en lo que antecede, el(los) conteni- do(s) en escualeno se puede comparar con el(los) contenido(s) estándar de escualeno con el fin de comprobar un fallo de producción.

El procedimiento de análisis

Los procedimientos de la invención se usan con adyuvantes en emulsión de aceite en agua que incluyen escualeno e implican medir el contenido en escualeno de (i) el propio adyuvante y/o (ii) una composición vacunal que incluye el adyuvante mezclado con un antígeno.

En la técnica se conocen varios ensayos de escualeno. Por ejemplo, la referencia 6 desvela un ensayo colorimétrico cuantitativo para escualeno.

La referencia 7 desvela un procedimiento de detección de ionización por llama en cromatografía de gases a alta temperatura para la cuantificación de escualeno en presencia de ácidos grasos libres, esteroles libres y especies moleculares de acilglicerol. La referencia 8 desvela un ensayo validado usando cromatografía de líquido de alto rendimiento con detección ultravioleta, con un límite de detección de 140 partes por billón. La referencia 9 desvela el uso de cromatografía de fluidos supercríticos en el análisis cuantitativo de escualeno. La referencia 10 desvela procedimientos de espectrometría de masas de tiempo de vuelo de desorción/ionización para el análisis de escualeno.

La referencia 11 desvela el uso de -cromatografía de gases-espectrometría de masas y cromatografía de líquidos de alto rendimiento con extracción con CO₂ supercrítico para analizar el contenido en escualeno. La referencia 12 desvela un procedimiento sencillo y fiable para la cuantificación de escualeno, a-tocoferol y esteroles mediante un procedimiento directo que implica un análisis cromatográfico de gases del material no saponificable tras la sililación. La referencia 13 desvela un procedimiento en el que el material no saponificable se fracciona mediante HPLC de fase normal en una columna de gel de sílice usando una fase móvil compuesta por hexano/propanol-2/agua, el eluato se monitoriza a 215 nm y el escualeno en la fracción de hidrocarburo recogida de este modo se cuantifica en una columna analítica eluida con hexano. Se pueden usar ensayos directos e indirectos, por ejemplo, el escualeno se puede someter primero a una saponificación fría, seguida por cromatografía de gases-espectrometría de masas del extracto de hexano.

Cuando se ha medido el contenido en escualeno de un adyuvante o un antígeno, se compara con un...

1. Un procedimiento para fabricar un adyuvante en emulsión de aceite en agua, que comprende las etapas de: (i) preparar una emulsión submicrónica de aceite en agua usando cantidades conocidas de un vehículo acuoso, un tensioactivo y escualeno; (ii) someter la emulsión a esterilización en filtro para proporcionar una emulsión esterilizada; (iii) medir el contenido en escualeno de la emulsión esterilizada; y (iv) comparar el contenido en escualeno medido en la etapa (iii) con el contenido en escualeno conocido de la etapa (i), en el que, si la comparación de la etapa (iv) revela que el contenido en escualeno ha cambiado significativamente entre las etapas (i) y (iii), se rechaza el adyuvante.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el adyuvante se rechaza si el contenido medido en la etapa (iii) difiere en más de ± 10% del contenido conocido de la etapa (i),

3. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el contenido en escualeno conocido de la etapa (i) es una concentración de escualeno entre 2% y 8% en volumen.

4. El procedimiento de la reivindicación 3, en el que el contenido en escualeno conocido de la etapa (i) es una concentración de escualeno entre 4% y 6% en volumen.

5. Un procedimiento de ensayo de control de calidad para un adyuvante en emulsión de aceite en agua de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el adyuvante comprende escualeno y en el que el procedimiento comprende una etapa de comparar el contenido real en escualeno del adyuvante con un contenido estándar en escualeno.

6. El procedimiento de cualquier reivindicación precedente, si el adyuvante tiene un contenido en escualeno aceptable se combina con un antígeno.

7. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que si el adyuvante tiene un contenido en escualeno aceptable se envasa en un kit como componente de kit junto con un componente de antígeno.

8. El procedimiento de la reivindicación 7, en el que los componentes del kit están en viales separados.

9. El procedimiento de la reivindicación R, en el que los viales están fabricados de un vidrio de borosilicato.

10. El procedimiento de la reivindicación 7 o la reivindicación 8 o la reivindicación 9, en el que el adyuvante es un adyuvante en bruto y, si el adyuvante tiene un contenido en escualeno aceptable, el procedimiento comprende extraer dosis unitarias del adyuvante en bruto para envasar como componentes de kit.

11. Un procedimiento de prueba de control de calidad de acuerdo con la reivindicación 1 para una vacuna que incluye un adyuvante en emulsión de aceite en agua que incluye escualeno, en el que el procedimiento comprende las etapas de: (i) comparar el contenido real de escualeno del adyuvante con un contenido estándar de escualeno; y, si el contenido real de escualeno es aceptable, (ii) bien preparar la vacuna combinando el adyuvante con un antígeno o envasando el adyuvante en un kit como componente de kit junto con un componente de antígeno.

12. El procedimiento de la reivindicación 11, en el que el contenido en escualeno estándar es una concentración de escualeno entre 2% y 8% en volumen.

13. El procedimiento de la reivindicación 12, en el que el contenido en escualeno estándar es una concentración de escualeno entre 4% y 6% en volumen.

14. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, en el que el adyuvante se rechaza si el contenido real difiere del contenido estándar en más de ± 10%.

15. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 14, en el que el antígeno es un antígeno del virus de la gripe.

16. El procedimiento de la reivindicación 15, en el que la vacuna incluye aproximadamente 15 µg, aproximadamente 10 µg, aproximadamente 7,5 µg, aproximadamente 5 µg, aproximadamente 3,8 µg, aproximadamente 1,9 µg o aproximadamente 1,5 µg de hemaglutinina por cepa de virus de la gripe.

17. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 16, en el que la vacuna incluye tiomersal o 2-fenoxietanol como conservante.

18. Un procedimiento que comprende una etapa de mezclar (i) un antígeno del virus de la gripe y (ii) un adyuvante en emulsión de aceite en agua que incluye escualeno, y en el que el procedimiento también incluye una etapa en la que se mide el contenido en escualeno mediante el procedimiento de la reivindicación 1 (a) en el adyuvante antes de la etapa de mezclado y/o (b) en la mezcla antígeno-adyuvante tras la etapa de mezclado.

19. El procedimiento de la reivindicación 18, en el que el contenido en escualeno medido en (a) o (b) se compara con el(los) contenido(s) en escualeno estándar con el fin de comprobar un fallo de producción.

20. El procedimiento de la reivindicación 19, en el que el contenido en escualeno estándar es una concentración de escualeno entre 2% y 8% en volumen.

21. El procedimiento de la reivindicación 20, en el que el contenido en escualeno estándar es una concentración de escualeno entre 4% y 6% en volumen.

22. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 18 a 21, en el que el adyuvante se rechaza si el contenido real difiere del contenido estándar en más de ± 10%.

23. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 18 a 21, en el que el contenido en escualeno se mide tanto en (a) como en (b).

24. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 18 a 21, en el que el contenido en escualeno se mide en (a) pero no en (b).

25. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 18 a 21, en el que el contenido en escualeno se mide en (b) pero no en (a).

26. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 25, en el que el antígeno del virus de la gripe tiene la hemaglutinina del subtipo H5.

27. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la emulsión es una emulsión en submicrones que comprende escualeno, Tween 80 y Span 85.

28. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 26, en el que la emulsión es una emulsión de escualeno, alfa-tocoferol y Tween 80.

29. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 26, en el que la emulsión es una emulsión que comprende escualeno, un tensioactivo no iónico hidrófilo de polioxietilenoalquiléter y un tensioactivo no iónico hidrófobo.

30. Un procedimiento para fabricar un adyuvante en emulsión de aceite en agua, que comprende las etapas de: (i) preparar una emulsión submicrónica de aceite en agua usando cantidades conocidas de un vehículo acuoso, un tensioactivo y escualeno; (ii) someter la emulsión a esterilización en filtro para proporcionar una emulsión esterilizada; y (iii) medir el contenido en escualeno de la emulsión esterilizada, en el que la emulsión es una emulsión de escualeno, alfa tocoferol y Tween 80.