PROCEDIMIENTO MEJORADO DE PRODUCCION DE LICOPENO MEDIANTE LA FERMENTACION DE CEPAS SELECCIONADAS DE BLAKESLEA TRISPORA.

El procedimiento de fermentación con cepas seleccionadas de B.

Trispora expuesto en la presente invención permite alcanzar unos niveles de producción de licopeno superiores a los actualmente descritos. Los métodos de aislamiento, purificación y formulación son aplicables a cualquier fuente natural de licopeno, especialmente a cultivos sumergidos de hongos mucorales de los géneros Blakeslea, Choanephora, Phycomyces o Mucor. El procedimiento de extracción permite una simplificación en el proceso de recuperación y un incremento de pureza del producto con respecto a los procedimientos anteriormente descritos. Los procedimientos de formulación proporcionan un alto valor añadido, ya que permiten obtener preparaciones estabilizadas de licopeno de aplicación directa en los campos alimentario y farmacéutico

Procedimiento mejorado de producción de licopeno mediante la fermentación de cepas seleccionadas de Blakeslea trispora.

Campo de la invención

El procedimiento de fermentación con cepas seleccionadas de B. trispora expuesto en la presente invención permite alcanzar unos niveles de producción de licopeno superiores a los actualmente descritos. Los métodos de aislamiento, purificación y formulación son aplicables a cualquier fuente natural de licopeno, especialmente a cultivos sumergidos de hongos mucorales de los géneros Blakeslea, Choanephora, Phycomyces o Mucor. El procedimiento de extracción permite una simplificación en el proceso de recuperación y un incremento de pureza del producto con respecto a los procedimientos anteriormente descritos. Los procedimientos de formulación proporcionan un alto valor añadido, ya que permiten obtener preparaciones estabilizadas de licopeno de aplicación directa en los campos alimentario y farmacéutico.

Estado de la técnica

Los carotenoides están ampliamente distribuidos en la naturaleza, confiriendo su característico color, desde amarillo hasta rojo profundo, a numerosas sustancias naturales como zanahorias, pimientos, tomates, flores o determinados microorganismos entre los que se encuentran ciertas bacterias, hongos y organismos fotosintéticos. Los carotenoides pueden clasificarse en dos tipos: (i) hidrocarburos puros denominados carotenos, entre los que se encuentran compuestos como ß-caroteno, a-caroteno, ?-caroteno o licopeno y (ii) moléculas denominadas xantofilas, las cuales contienen oxígeno en diferentes formas (grupos hidroxi, epoxi, etc.), entre las que se encuentran astaxantina, zeaxantina, capsantina, cantaxantina, luteína, etc. Ambos grupos de compuestos presentan un comportamiento diferente en cuanto a sus propiedades físico-químicas y solubilidad en disolventes orgánicos. Todos estos compuestos juegan un papel importante en la dieta humana habiéndose estudiado ampliamente sus propiedades como antioxidantes para la prevención del cáncer y otras enfermedades humanas y como precursores de la vitamina A. Recientemente se ha demostrado en ratas que el licopeno inhibe el efecto dañino del nitriloacetato férrico sobre el ADN y previene la necrosis del hígado [Matos H.R. et al. (2001) Arch. Biochem. Biophys. vol. 396]. Adicionalmente, debido a sus coloraciones desde amarilla hasta roja, los carotenoides poseen una gran importancia comercial como colorantes y aditivos alimentarios debido a sus efectos beneficiosos para la salud y a sus atractivos colores [Ninet L. y Renaut J. (1979) En: Peppler HJ., Perlman D. (eds). Microbial Technology, 2^nd. Edn, vol. 1 Academic Press, NY, pp. 529-544].

El licopeno (C₄₀H₅₆) es un intermediario de la ruta biosintética de ß-caroteno y las xantofilas. Posee un peso molecular de 536,85 y la siguiente fórmula molecular:

El licopeno, además de actuar como antioxidante, previene enfermedades cardiovasculares y algunos tipos de cáncer y actúa en el control del crecimiento [Giovannucci et al (1995) J Nat. Cancer Inst. 87: 1767-1776; Stahl W. y Sies, H. (1996) Arch. Biochem. Biophys. 336: 1-9; Clinton, SK. (1998) Nutr. Rev. 56: 35-51]. Esto ha dado lugar a un incremento de la demanda por parte de los consumidores. La obtención de licopeno como compuesto de alta pureza ha estado ligada en el pasado a la síntesis química [US 5208381; US 5166445; US 4105855; US 2842599]. No obstante, actualmente existen vías alternativas basadas en fuentes de licopeno de origen natural y procesos de extracción específicos.

La producción de carotenoides mediante biosíntesis microbiana es un ejemplo clásico de competencia entre los procesos químicos y los biológicos. Las preparaciones de licopeno de origen biológico se obtienen a partir de tomate [PCT WO 97/48287, EP 608027] o mediante la fermentación de hongos mucorales de los géneros Phycomyces, Blakeslea y Choanephora [GB 1008469, US 3097146, US 3369974, JP 73016189, JP 73016190, RU 2102416, WO 00/77234]. Para conseguir una máxima producción de carotenoides con B. trispora es preciso fermentar conjuntamente las cepas (+) y (-) [Ciegler, A. (1965) Advances in Applied Microbiology 7: 1-34; Plempel, M. (1965) Planta 65: 225-231; Sutter, RP. y Rafelson, ME. (1968) J. Bacteriology 95: 426-432]. El incremento de producción de carotenoides en cultivos mixtos está correlacionado con la producción de una familia de compuestos ácidos denominados factor ß o ácidos trispóricos [WO 00/77234, Caglioti L. et al. (1966) Tetrahedron Supplement 7: 175-187]. Para biosintetizar ácidos trispóricos, el ß-caroteno producido por las cepas (+) y (-) es metabolizado por ambas a retinal y posteriormente a 4-dihidrotrisporol. La cepa (+) utiliza el 4-dihidrotrisporol como sustrato para formar ácido dihidrotrispórico y su éster metílico (metil-4-dihidrotrisporato). Por su parte, la cepa(-) metaboliza el 4-dihidrotrisporol a trisporol. Finalmente, el metil-4-dihidrotrisporato es convertido en ácido trispórico por la cepa (-) y el trisporol es convertido en ácido trispórico por la cepa (+). Esta descripción de la biosíntesis de los ácidos trispóricos es una simplificación, ya que durante el proceso se generan muchos co-metabolitos, algunos de los cuales son comunes a ambas cepas (+) y (-), pero otros son específicos de una de ellas. Las cantidades relativas de dichos co-metabolitos varían en función de las cepas.

La ruta biosintética de ß-caroteno (ver esquema 1) ha sido descrita en hongos filogenéticamente relacionados con B. trispora como Phycomyces blakesleeanus y Mucor circinelloides [Arrach N. et al. (2001) Proceedings of the National Academic of Sciences USA 98: 1687-1692; Velayos A. et al. (2000) European Journal of Biochemistry 267: 5509-5519]. Para dicha biosíntesis son necesarias al menos tres actividades enzimáticas: (i) fitoeno sintasa, la cual une dos moléculas de geranilgeranil pirofosfato para formar fitoeno, (ii) fitoeno deshidrogenasa, la cual introduce cuatro dobles enlaces en la molécula de fitoeno para sintetizar licopeno, y (iii) licopeno ciclasa, la cual, utilizando licopeno como sustrato, se encarga de formar los anillos situados en ambos extremos de la molécula de ß-caroteno. El análisis de mutantes de B. trispora ha permitido concluir que la ruta biosintética de ß-caroteno en este hongo es similar a la descrita para P. blakesleeanus [Metha B.J. y Cerdá-Olmedo E. (1995) Applied Microbiology and Biotechnology 42: 836-838]. En el caso de P. blakesleeanus, el color amarillo de su micelio puede ser modificado mediante mutación dando lugar a cepas con micelio de color rojo, blanco o varias gradaciones de amarillo. Los mutantes rojos acumulan licopeno, mientras que los blancos carecen de producción de carotenoides o acumulan fitoeno. Para la producción de licopeno es preciso disponer de cepas de B. trispora carentes de actividad licopeno ciclasa o alternativamente adicionar al medio de fermentación compuestos químicos inhibidores de la citada actividad enzimática.

Esquema 1

En las patentes GB 1008469, US 3097146, US 3369974, JP 73016189, JP 73016190, RU 2102416 y WO 00/77234 se describe la obtención de licopeno mediante la fermentación de hongos mucorales como Phycomyces, Blakeslea y Choanephora. Las patentes GB 1008469 y US 3097146 describen métodos de fermentación de B. trispora basados en el control del pH entre valores de 7,0 y 9,5, obteniendo producciones de 99,7 mg/l de licopeno tras 7 días de fermentación. Las patentes JP 73016189 Y JP 73016190 describen métodos de producción de licopeno con hongos mucorales basados en la adición aminas terciarias. La patente RU 2102416 describe la adición de aminometilpiridinas y restos de tabaco para inducir la acumulación de licopeno. Además de las sustancias descritas en dichas patentes, se ha publicado el uso de otras bases nitrogenadas heterocíclicas para bloquear la síntesis de carotenoides a nivel de licopeno: nicotina [JP 09313167], imidazol, piridina, morfolina, quinolina y algunos derivados sustituidos [US 3369974; Ninet L., Renaut J. (1979) En: Peppler HJ, Perlman D (eds). Microbial Technology, 2^nd. Edn, vol. 1 Academic Press, NY, pp. 529-544]. Asimismo, se han descrito mutantes de B. trispora que acumulan licopeno sin la necesidad de...

1. Proceso de producción de formulaciones de licopeno a partir de fuentes biosintéticas, que comprende las siguientes etapas en sucesión: