Polipéptido WISP-2 para su utilización en un procedimiento para el tratamiento de daños celulares o en tejidos de cartílago en un trastorno cartilaginoso degenerativo

Polipéptidos WISP y aplicaciones terapéuticas de los mismos.

Campo de la invención

La presente invención se refiere de manera general a métodos de utilización de polipéptidos WISP en el tratamiento de trastornos cartilaginosos degenerativos y diversas condiciones de tipo inmunológico.

Antecedentes de la invención

El factor de crecimiento de tejido conectivo (CTGF) es un factor de crecimiento inducido en fibroblastos por muchos factores, incluyendo TGF-ß, y resulta esencial para la capacidad de TGF-ß de inducir el crecimiento independiente de anclaje (AIG), una propiedad de las células transformadas. Se descubrió el CTGF en un intento para identificar el tipo de dímeros de factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) presente en el medio de cultivo de células endoteliales, y se relaciona inmunológica y biológicamente con PDGF. Ver la patente US nº 5.408.040. CTGF también es mitogénica y quimiotáctica de células, y de esta manera los factores de crecimiento en esta familia se cree que desempeñan un papel en el desarrollo, crecimiento y reparación normales del tejido humano.

Se han aislado, clonado, secuenciado y caracterizado como pertenecientes a la familia del gen CCN siete proteínas relacionadas con CTGF, incluyendo el ortólogo de pollo de Cyr61, CEF10, CTGF humano, de ratón y de Xenopus laevis, y Nov humano, de pollo y de Xenopus laevis (Oemar y Luescher, Arterioscler. Thromb. Vas. Biol. 17:1483-1489, 1997). El gen codificante de Cyr61 se ha encontrado que estimula la angiogénesis, el crecimiento tumoral y la vascularización (Babic et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:6355-6360, 1998). El gen nov se expresa en el riñón esencialmente en el estadio embrionario, y se han detectado alteraciones de la expresión de nov, en comparación con la expresión en el riñón normal, tanto en nefroblastomas aviares como en tumores de Wilms humanos (Martinerie et al., Oncogene 9:2729-2732, 1994). Wt1 regula negativamente la expresión humana de nov, regulación negativa que podría representar un elemento crucial en la nefrogénesis normal y tumoral (Martinerie et al., Oncogene 12:1479-1492, 1996). Recientemente se ha propuesto que los genes de CTGF, nov y cyr61, que codifican proteínas secretadas que contienen secuencias conservadas y motivos de IGFBP en los extremos N-terminales de los mismos y se unen a IGFs con baja afinidad, son otros miembros de la superfamilia de IGFBP, junto con el mac25/IGFBP-7 de baja afinidad (Yamanaka et al., J. Biol. Chem. 272:30729-30734, 1997) y las IGFBPs 1-6 de alta afinidad. CTGF bajo esta proposición se denominaría IGFBP-8 (Kim et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:12981-12986, 1997).

Los diferentes miembros de la familia de CCN interaccionan con diversas macromoléculas solubles y asociadas a la matriz, en particular glucoconjugados sulfatados (Holt et al., J. Biol. Chem. 265:2852-2855, 1990). Esta interacción ha sido utilizada para purificar Cyr61 y CTGF mediante cromatografía de afinidad en heparina-agarosa (Frazier et al., J. Invest. Dermatol. 107:404-411, 1996; Kireeva et al., Mol. Cell. Biol. 16:1326-1334, 1996). Cyr61 resulta secretada y se encuentra asociada tanto a la matriz extracelular como a la superficie celular debido a la afinidad del mismo para el heparán sulfato (Yang et al., Cell. Growth Diff. 2:351-357, 1991).

Recientemente, se ha encontrado una proteína en el ratón denominada ELM1 que se expresa en células de capacidad metastásica reducida (Hashimoto et al., J. Exp. Med. 187:289-296, 1996). El gen elm1, un homólogo de ratón de WISP-1, dado a conocer posteriormente, es otro miembro de la familia de CTGF, Cyr61/Cef10 y el gen sobreexpresado del neuroblastoma, y suprime el crecimiento tumoral in vivo y la metástasis de las células de melanoma murino K-1735. Otro artículo reciente sobre rCop-1, el ortólogo de rata de WISP-2 indicado posteriormente, describe la pérdida de expresión de este gen tras la transformación celular (Zhang et al., Mol. Cell. Biol. 18:6131-6141, 1998).

Los miembros de la familia de CCN (con la excepción de nov) son genes sensibles al crecimiento temprano inmediato que se cree regulan la proliferación celular, diferenciación, embriogénesis y cicatrización de heridas. La homología de secuencias entre miembros de la familia del gen CCN es bastante elevada; sin embargo, las funciones de estas proteínas in vitro van desde la estimulatoria del crecimiento (la CTGF humana) hasta la inhibidora del crecimiento (Nov de pollo y posiblemente también hCTGF). Además, está indicada la utilidad de algunas moléculas homólogas en la prevención de la desmoplasia, la formación de estroma de tejido conectivo altamente celular y excesiva asociada con algunos cánceres, y lesiones fibróticas asociadas a diversos trastornos de la piel, tales como escleroderma, queloide, fascitis eosinofílica, fascitis nodular y contractura de Dupuytren. Además, recientemente se ha demostrado que CTGF se expresa en el estroma fibroso de los tumores mamarios, sugiriendo que la formación de estroma en el cáncer implica la inducción de factores de crecimiento fibroproliferativos similares a los de la reparación de heridas. El CTGF humano también se expresa a niveles muy altos en las lesiones ateroescleróticas avanzadas, pero no en las arterias normales, sugiriendo que podría desempeñar un papel en la ateroesclerosis (Oemar y Luescher, supra).

Los Wnts se encuentran codificados por una familia génica amplia los miembros de la cual se han encontrado en ascáridos, insectos, peces cartilaginosos y vertebrados (Holland et al., Dev. Suppl., 125-133, 1994). Se cree que los Wnts funcionan en una diversidad de procesos del desarrollo y fisiológicos debido a que muchas especies diversas presentan múltiples genes Wnt conservados (McMahon, Trends Genet. 8:236-242, 1992; Nusse y Varmus, Cell 69:1073-1087, 1992). Los genes Wnt codifican glucoproteínas secretadas que se cree funcionan como señales paracrinas y autocrinas en varios tipos celulares primitivos (McMahon, supra, 1992; Nusse y Varmus, supra, 1992). La familia del factor de crecimiento Wnt incluye más de diez genes identificados en el ratón (Wnt-1, -2, -3A, -3B, -5A, -5B, -6, -7A, -8A, -8B, -10B, -11, -12 y -13) (ver, por ejemplo, Gavin et al., Genes Dev. 4:2319-2332, 1990; Lee et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:2268-2272, 1995; Christiansen et al., Mech. Dev. 51:341-350, 1995) y por lo menos nueve genes identificados en el ser humano (Wnt-1, -2, -3, -5A, -7A, -7B, -8B, -10B y -11) mediante clonación de ADNc (ver, por ejemplo, Vant Veer et al., Mol. Cell. Biol. 4:2532-2534, 1984).

El protooncogén Wnt-1 (int-1) originalmente se identificó en tumores mamarios inducidos por el virus del tumor mamario de ratón (MMTV) debido a una inserción de una secuencia de ADN vírico (Nusse y Varmus, Cell 31:99-109, 1982). En ratones adultos, el nivel de expresión de ARNm de Wnt-1 se detecta únicamente en los testículos durante estadios tardíos del desarrollo espermático. La proteína Wnt-1 presenta aproximadamente 42 kDa y contiene una región aminoterminal hidrofóbica que podría funcionar como secuencia de señal para la secreción (Nusse y Varmus, supra, 1992). La expresión de Wnt-2/irp se detecta en tejidos fetales y adultos de ratón y la distribución del mismo no se solapa con el patrón de expresión de Wnt-1. Wnt-3 se encuentra asociado con la tumorigénesis mamaria del ratón. La expresión de Wnt-3 en embriones de ratón se detecta en los tubos neurales y en los gérmenes de las extremidades. Se detectan transcritos de Wnt-5a en las extremidades anteriores y posteriores en desarrollo entre los días 9,5 y 14,5 y los niveles más altos se concentran en el ectodermo apical en la punta distal de las extremidades (Nusse y Varmus, supra, 1992). Recientemente, se ha descrito un factor de crecimiento Wnt denominado Wnt-x (patente WO nº 95/17416) junto con la detección de la expresión de Wnt-x en tejidos óseos y en células derivadas de hueso. También se describe el papel de Wnt-x en el mantenimiento de los osteoblastos maduros y la utilización del factor de crecimiento Wnt-x como agente terapéutico o en el desarrollo de otros agentes terapéuticos para tratar las enfermedades de tipo óseo.

Wnts podría desempeñar un papel en la señalización celular local. Algunos estudios bioquímicos han demostrado que gran parte de la proteína Wnt secretada puede encontrarse asociada con la superficie celular o con la matriz extracelular, y no libremente difundible en el medio (Papkoff y Schryver, Mol. Cell. Biol. 10:2723-2730,...

1. Polipéptido WISP-2 para su utilización en un procedimiento para el tratamiento de daños celulares o en tejidos de cartílago en un trastorno cartilaginoso degenerativo.

2. Utilización del polipéptido WISP-2 para la preparación de un medicamento para el tratamiento de daños celulares o en tejidos de cartílago en un trastorno cartilaginoso degenerativo.

3. Polipéptido WISP-2 para su utilización según la reivindicación 1 o la utilización según la reivindicación 2, en el que dicho cartílago es cartílago articular.

4. Polipéptido WISP-2 para su utilización según la reivindicación 1 o la utilización según la reivindicación 2, en el que el trastorno cartilaginoso degenerativo es artritis reumatoide u osteoartritis.

5. Polipéptido WISP-2 para su utilización o la utilización según la reivindicación 4, en el que el trastorno cartilaginoso degenerativo es artritis reumatoide.

6. Polipéptido WISP-2 para su utilización o la utilización según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho polipéptido WISP es un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en:

(a) un polipéptido WISP-2 que comprende los aminoácidos 24 a 250 de la SEC ID nº 10;
(b) un polipéptido WISP-2 que comprende los aminoácidos 1 a 250 de la SEC ID nº 10;
(c) un polipéptido WISP-2 que presenta una identidad de por lo menos el 90% con el polipéptido (a) o (b); en el que dicho polipéptido WISP-2 estimula la proliferación o la diferenciación de condrocitos; y
(d) un fragmento biológicamente activo del polipéptido WISP-2 de (a) o (b), en el que dicho fragmento biológicamente activo estimula la proliferación o la diferenciación de condrocitos.

7. Polipéptido WISP-2 para su utilización o la utilización según la reivindicación 6, en el que dicho polipéptido WISP-2 comprende los aminoácidos 24 a 250 de la SEC ID nº 10.

8. Polipéptido WISP-2 para su utilización o la utilización según la reivindicación 6, en el que dicho polipéptido WISP-2 se encuentra unido a una o más moléculas de polietilenglicol.

9. Polipéptido WISP-2 para su utilización o la utilización según la reivindicación 6, en el que dicho polipéptido WISP-2 se encuentra unido a una etiqueta epítopo o a una molécula de inmunoglobulina.

10. Polipéptido WISP-2 para su utilización o la utilización según la reivindicación 6, en el que el polipéptido WISP-2 o el medicamento son para el contacto con células o tejido de cartílago de mamífero en cultivo previamente al trasplante en un mamífero.

11. Polipéptido WISP-2 para su utilización o la utilización según la reivindicación 6, en el que el polipéptido WISP-2 está comprendido en una composición que comprende además, o el medicamento comprende además, un portador farmacéuticamente aceptable.

12. Procedimiento in vitro o ex vivo para tratar células o tejido de cartílago de mamífero, que comprende poner en contacto células o tejido de cartílago de mamífero dañados por un trastorno cartilaginoso degenerativo con una cantidad eficaz de polipéptido WISP, en el que dicho polipéptido WISP es un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en:

(a) un polipéptido WISP-2 que comprende los aminoácidos 24 a 250 de la SEC ID nº 10;
(b) un polipéptido WISP-2 que comprende los aminoácidos 1 a 250 de la SEC ID nº 10;
(c) un polipéptido WISP-2 que presenta una identidad de por lo menos el 90% con el polipéptido de (a) o (b), en el que dicho polipéptido WISP-2 estimula la proliferación o la diferenciación de condrocitos; y
(d) un fragmento biológicamente activo del polipéptido WISP-2 de (a) o (b), en el que dicho fragmento biológicamente activo estimula la proliferación o la diferenciación de condrocitos.

13. Procedimiento según la reivindicación 12, en el que dicho polipéptido WISP-2 comprende los aminoácidos 24 a 250 de la SEC ID nº 10.

14. Procedimiento según la reivindicación 12, en el que dicho polipéptido WISP-2 se encuentra unido a una o más moléculas de polietilenglicol.

15. Procedimiento según la reivindicación 12, en el que dicho polipéptido WISP-2 se encuentra unido a una etiqueta epítopo o a una molécula de inmunoglobulina.

16. Procedimiento según la reivindicación 12, en el que dicho cartílago es cartílago articular.

17. Procedimiento según la reivindicación 12, en el que el trastorno cartilaginoso degenerativo es artritis reumatoide u osteoartritis.

18. Procedimiento según la reivindicación 17, en el que el trastorno cartilaginoso degenerativo es artritis reumatoide.

19. Procedimiento según la reivindicación 12, en el que el polipéptido WISP se encuentra incluido en un portador farmacéuticamente aceptable.

20. Polipéptido WISP-2 para su utilización en un procedimiento para el tratamiento de una lesión celular o en tejido de cartílago de mamífero, en el que dicho polipéptido WISP-2 es un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en:

(a) un polipéptido WISP-2 que comprende los aminoácidos 24 a 250 de la SEC ID nº 10;
(b) un polipéptido WISP-2 que comprende los aminoácidos 1 a 250 de la SEC ID nº 10;
(c) un polipéptido WISP-2 que presenta una identidad de por lo menos el 90% con el polipéptido de (a) o (b); en el que dicho polipéptido WISP-2 estimula la proliferación o la diferenciación de condrocitos; y
(d) un fragmento biológicamente activo del polipéptido WISP-2 de (a) o (b), en el que dicho fragmento biológicamente activo estimula la proliferación o la diferenciación de condrocitos.

21. Utilización de polipéptido WISP para la preparación de un medicamento para el tratamiento de una lesión celular o en tejido de cartílago de mamífero, en el que dicho polipéptido WISP es un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en:

(a) un polipéptido WISP-2 que comprende los aminoácidos 24 a 250 de la SEC ID nº 10;
(b) un polipéptido WISP-2 que comprende los aminoácidos 1 a 250 de la SEC ID nº 10;
(c) un polipéptido WISP-2 que presenta una identidad de por lo menos el 90% con el polipéptido de (a) o (b); en el que dicho polipéptido WISP-2 estimula la proliferación o la diferenciación de condrocitos; y
(d) un fragmento biológicamente activo del polipéptido WISP-2 de (a) o (b), en el que dicho fragmento biológicamente activo estimula la proliferación o la diferenciación de condrocitos.

22. Polipéptido WISP-2 para su utilización según la reivindicación 20 o la utilización según la reivindicación 21, en el que la lesión es una microdaño o un traumatismo por contusión, una fractura condral, una fractura osteocondral o daño en menisco, tendón o ligamento.

23. Polipéptido WISP-2 para su utilización según la reivindicación 20 o la utilización según la reivindicación 21, en el que dicho polipéptido WISP está destinado a la administración en un mamífero mediante inyección en dichas células o tejido de cartílago o en una articulación del mamífero.

24. Polipéptido WISP-2 para su utilización según la reivindicación 20 o la utilización según la reivindicación 21, en el que dicho polipéptido WISP-2 comprende los aminoácidos 24 a 250 de la SEC ID nº 10.

25. Polipéptido WISP-2 para su utilización según la reivindicación 20 o la utilización según la reivindicación 21, en el que dicho polipéptido WISP-2 se encuentra unido a una o más moléculas de polietilenglicol.

26. Polipéptido WISP-2 para su utilización según la reivindicación 20 o la utilización según la reivindicación 21, en el que dicho polipéptido WISP-2 se encuentra unido a una etiqueta epítopo o a una molécula de inmunoglobulina.

27. Polipéptido WISP-2 para su utilización según la reivindicación 20 o la utilización según la reivindicación 21, en el que el polipéptido WISP-2 o el medicamento es para el contacto con células o tejido de cartílago de mamífero en cultivo previamente al trasplante en un mamífero.

28. Polipéptido WISP-2 para su utilización según la reivindicación 20 o la utilización según la reivindicación 21, en el que el polipéptido WISP-2 está comprendido en una composición que comprende además, o el medicamento comprende además, un portador farmacéuticamente aceptable.

29. Procedimiento in vitro o ex vivo para tratar células o tejido de cartílago de mamífero, que comprende poner en contacto células o tejido de cartílago de mamífero dañados por lesión con una cantidad eficaz de polipéptido WISP, en el que dicho polipéptido WISP es un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en:

(a) un polipéptido WISP-2 que comprende los aminoácidos 24 a 250 de la SEC ID nº 10;
(b) un polipéptido WISP-2 que comprende los aminoácidos 1 a 250 de la SEC ID nº 10;
(c) un polipéptido WISP-2 que presenta una identidad de por lo menos el 90% con el polipéptido de (a) o (b), en el que dicho polipéptido WISP-2 estimula la proliferación o la diferenciación de condrocitos; y
(d) un fragmento biológicamente activo del polipéptido WISP-2 de (a) o (b), en el que dicho fragmento biológicamente activo estimula la proliferación o la diferenciación de condrocitos.

30. Procedimiento según la reivindicación 29, en el que la lesión es un microdaño o un traumatismo por contusión, una fractura condral, una fractura osteocondral o daño en el menisco, tendón o ligamento.

31. Procedimiento según la reivindicación 29, en el que dicho polipéptido WISP-2 comprende los aminoácidos 24 a 250 de la SEC ID nº 10.

32. Procedimiento según la reivindicación 29, en el que dicho polipéptido WISP-2 se encuentra unido a una o más moléculas de polietilenglicol.

33. Procedimiento según la reivindicación 29, en el que el polipéptido WISP-2 se encuentra unido a una etiqueta epítopo o a una molécula de inmunoglobulina.

34. Procedimiento según la reivindicación 29, en el que el polipéptido WISP se encuentra incluido en un portador farmacéuticamente aceptable.

35. Producto de fabricación que comprende: (a) un recipiente que contiene una composición que resulta eficaz para tratar un trastorno cartilaginoso, en el que la composición comprende una cantidad eficaz de polipéptido WISP-2 para tratar un trastorno cartilaginoso, y (b) instrucciones para utilizar dicho polipéptido WISP para tratar un trastorno cartilaginoso.